黃玉蘭，殷奎德，岳才軍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

黃瓜屬葫蘆科黃瓜屬植物，其鮮果脆嫩多汁，營養(yǎng)豐富，清香可口，深受人們喜愛［1］。總黃酮類化合物作為一種功能成分，具有許多有益的生理效應(yīng)與藥理作用，越來越引起人們的重視［2-5］，隨著人們對(duì)總黃酮類物質(zhì)的生物效能的逐步認(rèn)識(shí)，對(duì)黃酮類化合物的研究也日益增多，有研究表明黃瓜葉中含有豐富的黃酮類物質(zhì)［6］，而直接從黃瓜葉中提取總黃酮，不但耗費(fèi)植物材料，而且生產(chǎn)周期長。在培養(yǎng)的植物細(xì)胞、組織中，大部分次生代謝產(chǎn)物的含量超過了野生植物的含量，因此以黃瓜培養(yǎng)細(xì)胞為材料提取該物質(zhì)就成為一條重要的途徑，黃瓜培養(yǎng)細(xì)胞有兩種，一種是以固體培養(yǎng)的愈傷組織細(xì)胞，一種是以液體進(jìn)行的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞［7］。懸浮細(xì)胞可不斷增值，生長速度快，更有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取，而懸浮細(xì)胞體系建立的重要前提是愈傷組織的誘導(dǎo)。

本試驗(yàn)以黃瓜無菌苗不同外植體為材料進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析方法對(duì)黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)基中激素濃度組合進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳的激素配比，為黃瓜進(jìn)一步懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及生產(chǎn)次生代謝物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瓜津研4號(hào)由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 消毒方法 將黃瓜種子用清水洗凈，在超凈工作臺(tái)中用 0.1%升汞溶液浸泡10 min，75%乙醇浸30-60 s，無菌水沖洗5次后，備用。

1.2.2 初代愈傷組織的獲得 將消毒好的黃瓜種子接種于不含任何激素的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行暗培養(yǎng)，制備無菌苗。將5-7 d無菌苗子葉葉片切成0.5 cm ×0.5 cm 的小塊;胚軸和胚根切成 0.3-0.5 cm的小段，用長柄鑷子將切好的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA中，注意外植體的切口處向下(接觸培養(yǎng)基表面)。然后再以封口膜將三角錐瓶封上。將接種的培養(yǎng)瓶放入組織培養(yǎng)室的光照架上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，獲得初代愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率 =接種后第20 d產(chǎn)生愈傷組織的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。同時(shí)篩選出誘導(dǎo)初代愈傷組織的最佳外植體。

1.2.3 愈傷組織繼代培養(yǎng)激素配比設(shè)計(jì) 邱超等研究表明，6-BA是黃瓜組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)愈傷組織形成必不可少的植物生長調(diào)節(jié)劑［8］，并根據(jù)一些文獻(xiàn)報(bào)道［9-10］，選擇組織培養(yǎng)中常用的三種激素6-BA，IAA，AgN03為試驗(yàn)因素，考察各因素不同水平下對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響，選擇最佳的單因素激素條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，結(jié)果如表1，共20個(gè)組合，設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)(表2)。

1.2.4 最佳培養(yǎng)基的篩選 將培養(yǎng)15 d的初代愈傷組織切成大小平均為0.3 g的小塊，接入表2設(shè)計(jì)的不同培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶4塊，每個(gè)處理共20塊，總質(zhì)量為 6 g，即初始鮮重為6 g。接種15 d以后，再以初始鮮重的方法進(jìn)行稱重即為最終鮮重，(最終鮮重－初始鮮重)即凈增鮮重為指標(biāo)，進(jìn)行最佳培養(yǎng)基的篩選。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 在不同因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以6-BA，IAA，AgN03為考察變量，以凈增鮮重為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert7.1軟件，優(yōu)化黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素濃度的組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況

表1為不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況。從表1可見，子葉和下胚軸均有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，而胚根和真葉的愈傷組織誘導(dǎo)情況不理想，胚根誘導(dǎo)的愈傷組織有褐化現(xiàn)象，真葉的誘導(dǎo)率較低，誘導(dǎo)率只是子葉和下胚軸的一半。下胚軸與子葉相比，誘導(dǎo)的愈傷組織的數(shù)量相差不多，但愈傷組織呈水漬狀，質(zhì)量較差，不適合繼代培養(yǎng)。而子葉誘導(dǎo)的愈傷組織無論從顏色，數(shù)量和質(zhì)量上都相對(duì)較好，而且其實(shí)生苗利用率較高，每株無菌實(shí)生苗上可獲取6-8個(gè)。前期實(shí)驗(yàn)表明，子葉中的總黃酮含量高于下胚軸，因此，確定子葉為愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體。

表1 不同類型外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.1 Effect of different explants on cullus induction

2.2 愈傷組織繼代培養(yǎng)激素配比的優(yōu)化

2.2.1 6-BA對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響 將初代培養(yǎng)的黃瓜愈傷組織6.00 g，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)，在固定條件下:IAA為0.5 mg/L，AgN03為1 mg/L條件下，選擇不同激素濃度 0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8 mg/L條件下，考察6-BA對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度6-BA對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響Fig.1 Effects of different 6-BA on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

由圖1可知，隨著6-BA濃度的增大，愈傷組織凈增鮮重不斷增加，當(dāng)濃度增加到1.0 mg/L時(shí)，凈增鮮重開始下降。這也正符合激素誘導(dǎo)愈傷組織的一般規(guī)律，雖然其中促進(jìn)細(xì)胞分裂，促進(jìn)非分化組織分化，促進(jìn)生物體內(nèi)物質(zhì)的積累。但6-BA的另一個(gè)重要特征是在植物體內(nèi)的移動(dòng)性差，其生理作用局限于處理部位及其附近，而且隨著6-BA濃度的增加愈傷組織有褐化的趨勢，褐化會(huì)影響組織分化，進(jìn)而影響愈傷組織凈增鮮重。因此認(rèn)為6-BA濃度1.0 mg/L左右為宜。

2.2.2 IAA對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響 將初代培養(yǎng)的黃瓜愈傷組織6.00 g，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)，在固定條件下:6-BA 為1.0 mg/L，AgN03為 1.0 mg/L 條件下，選擇不同激素濃度 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mg/L條件下，考察IAA對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度IAA對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響Fig.2 Effects of different IAA on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

由圖2可知，隨著IAA濃度的增大，愈傷組織凈增鮮重不斷增加，當(dāng)濃度增加到0.5 mg/L時(shí)，凈增鮮重開始緩慢，而當(dāng)濃度達(dá)到0.9 mg/L時(shí)，凈增鮮重顯著下降。不同種類的外源激素對(duì)黃瓜愈傷的誘導(dǎo)和分化作用是不同的，IAA通過改變愈傷組織中內(nèi)源激素含量而起作用的。主要可能通過影響有關(guān)激素“庫”大小的酶活性(過氧化物酶和IAA氧化酶)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)中即使較低濃度的IAA也能誘導(dǎo)出較高量的愈傷組織?？梢?，愈傷組織的增值是受組織內(nèi)激素IAA的濃度調(diào)控的，認(rèn)為IAA濃度0.5 mg/L左右為宜。

2.2.3 AgN03對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響 將初代培養(yǎng)的黃瓜愈傷組織6.00 g，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)，在固定條件下:6-BA 為1.0 mg/L，IAA 為0.5 mg/L條件下，選擇不同激素濃度 0.5、0.7、0.9、1.0、1.2、1.5 mg/L條件下，考察AgN03對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度AgN03對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響Fig.3 Effects of different AgN03on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

從圖3可以看出，隨著AgN03的增加，愈傷組織的凈增鮮重也隨之增加，當(dāng)濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，凈增鮮重有下降的趨勢。本研究中添加AgNO3提高了愈傷組織誘導(dǎo)率，這主要是低濃度的AgNO3能夠有效抑制培養(yǎng)物形成乙烯，減少組織老化變褐，誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生［11］。但當(dāng)AgNO3濃度高于1.0 mg/L后，對(duì)愈傷組織生長可能轉(zhuǎn)成了抑制作用，這可能是濃度過高降低了激素的水平，產(chǎn)生了毒害作用［12］。

2.3 愈傷組織繼代培養(yǎng)激素配比的優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇6-BA，IAA，AgN03為自變量，根據(jù)中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素五水平的響應(yīng)面分析法，確定愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素組合的最佳配比。利用 De-sign Expert7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2、3。

2.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到數(shù)學(xué)模型為:Y=23.03+0.084X1+0.059X2+0.088X3+0.013X1X2+0.013X1X3+0.013X2X3 －1.17X12－0.070X22－0.18X32。對(duì)表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的方差分析結(jié)果如表4所示。由表4可知，6-BA，IAA，AgN03的一次項(xiàng)，平方項(xiàng)均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。由 F值可知，各因素對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響次序?yàn)?6-BA(X3)＞AgN03(X1)＞IAA(X2)。此模型的決定系數(shù)R2為0.9957，經(jīng)擬合檢驗(yàn)可知該二次方程模型達(dá)到極顯著水平，并且失擬項(xiàng)不顯著，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，能夠正確反映愈傷組織凈增鮮重與6-BA，IAA，AgN03激素之間的關(guān)系。

表2 因素水平編碼表Tab.2 Coding of factors and levels

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Test designs and results

表4 回歸模型各項(xiàng)的方差分析Tab.4 Variance analysis of regression equation

2.3.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程，做出各個(gè)激素組合對(duì)黃瓜愈傷組織凈增鮮重的響應(yīng)面和等高線，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析6-BA，IAA，AgN03三種激素濃度對(duì)黃瓜愈傷組織凈增鮮重的影響，見圖4～6。等高線圖直觀地反映出三種激素的交互作用對(duì)愈傷組織凈增鮮重的影響。橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示兩因素之間的交互作用不明顯。由圖可以看出，6-BA和IAA，6-BA和AgN03的交互作用顯著，IAA和AgN03交互作用較小。

圖4 6-BA和IAA對(duì)黃瓜愈傷組織凈增鮮重的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour for effects of 6-BA and IAA on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

圖5 6-BA和AgN03對(duì)黃瓜愈傷組織凈增鮮重的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour for effects of 6-BA and AgN03on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

圖4～6直觀地反映了各激素對(duì)凈增鮮重的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。比較3組圖可知:6-BA對(duì)黃瓜愈傷組織凈增鮮重影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡;而 IAA和AgN03，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。同時(shí)也說明了6-BA是黃瓜脫分化過程中必須激素之一。

2.3.4 最佳激素的配比及驗(yàn)證 為進(jìn)一步確定最佳的激素濃度，在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn)，按照模型使用快速上升法優(yōu)化，可得愈傷組織凈增鮮重的最佳激素配比為:6-BA為1.0091 mg/L，IAA為0.5502 mg/L，AgN03為 1.1026 mg/L，在此最佳激素配比下愈傷組織凈增鮮重的理論提取率23.14 g。在此激素條件下，實(shí)際測得的平均提取率23.13 g，與預(yù)測值基本一致，證實(shí)了該模型的有效性。因此選出的培養(yǎng)基 MS+6-BA1.009 mg/L+IAA 0.5502 mg/L+AgN031.1026 mg/L為黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)的黃瓜愈傷組織為黃綠色，質(zhì)地緊密，數(shù)量較多。在最佳激素濃度組合后的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織見圖7A。

圖6 IAA和AgN03對(duì)黃瓜愈傷組織凈增鮮重的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour for effects of IAA and AgN03on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

2.3.5 黃瓜細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 將最佳培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好的愈傷組織，接種到不加瓊脂的液體培養(yǎng)基:MS+6-BA 1.009 mg/L+IAA 0.5502 mg/L+AgN031.1026 mg/L中進(jìn)行黃瓜細(xì)胞的液體懸浮培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，懸浮細(xì)胞可不斷增值，生長速度快，狀態(tài)良好，懸浮細(xì)胞見圖7B。

圖7 最佳培養(yǎng)基的黃瓜愈傷組織及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)Fig.7 Cucumber callus induced under optimized culture condition and cucumber suspension cells of cucumber

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過黃瓜外植體的不同部位的愈傷組織誘導(dǎo)情況，得出子葉為愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體。在愈傷組織繼代培養(yǎng)激素優(yōu)化的過程中采用響應(yīng)面分析方法，確定的數(shù)學(xué)模型為:Y=23.03+0.084X1+0.059X2+0.088X3+0.013X1X2+0.013X1X3+0.013X2X3 －1.17X12－0.070X22－0.18X32。通過模擬尋優(yōu)得到的黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為:MS+6-BA1.009 mg/L+IAA 0.5502 mg/L+AgN031.1026 mg/L，并且得到黃瓜最大愈傷組織凈增鮮重為23.14 g。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在篩選出的最佳培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到的黃瓜愈傷組織凈增鮮重為23.13 g，與預(yù)測值基本一致。此結(jié)果說明，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)黃瓜愈傷組織增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化是可行的，同時(shí)在最佳培養(yǎng)基進(jìn)行黃瓜細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，增值速度快，生長狀態(tài)良好，為進(jìn)一步研究黃瓜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

［1］任綠枝，李珊珊，王東方，等.高效黃瓜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究［J］.山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，25(3):32-35.REN Luzhi，LI Shanshan，WANG Dongfang，et al.Research on efficient callus culture of cucumber［J］.Journal of Shandong Polytechnic University，2011，25(3):32-35.

［2］張婉，唐麗，謝坤，等.蒿屬植物黃酮類化學(xué)成分及藥理活性研究概況［J］.中央民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，18(1):73-77.ZHANG Wan，TANG Li，XIE Kun，et al.Studies on chemical constituents and pharmacological activities of Artemisia plant flavonoids［J］.Journal of Minzu University of China:Natural Science Edition，2009，18(1):73-77.

［3］潘國慶，梁永欣.黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與抗氧化活性關(guān)系研究［J］.研究與開發(fā)，2005，12(3):28-30.PAN Guoqing，LIANG Yongxin.Study on the relationship between structure and antioxidant activity of flavonoids compounds［J］.Research and Development，2005，12(3):28-30.

［4］HUANG H Y，CHA X L.Development in research of antitumor effect of flavones compounds［J］.Chinese Journal of New Drugs and Clinical Remedies，2002，21(7):428-433.

［5］YANG D M，XU SHB.The preliminary research of anti-inflammation and toxicity of cansora Lucidissima Hand Mazz［J］.Academic Journal of Guangdong College of Pharmacy，2001，17(1):33-35.

［6］蔡健，王薇.黃瓜葉中總黃酮含量的研究［J］.食品學(xué)報(bào)，2005，26(8):194-196.CAI Jian，WANG Wei.Study on the total flavonoids content in leaves of cucumber［J］.Journal of Food，2005，26(8):194-196.

［7］王麗艷，荊瑞勇，郭永霞，等.大豆愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素濃度組合的優(yōu)化［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2013，35(4)446-450.WANG Liyan，JING Ruiyong，GUO Yongxia，et al.Optimum combination of hormone concentration during callus subculture of soybean［J］.Chinese Journal of Oil Crop，2013，35(4)446-450.

［8］邱超，黃作喜.黃瓜組織培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25(增):487-489.QIU Chao， HUANG Zuoxi. Advances in tissue culture of Cucumber［J］.Journal of Neijiang Normal University，2010，25(adding):487-489.

［9］王梅，李銘，陳麗，等.黃瓜愈傷組織誘導(dǎo)研究技術(shù)［J］.墨室園藝，2004(3)54-56.WANG Mei，LI Ming，CHEN Li，et al.Study of callus induction cucumber［J］.The Ink Chamber Gardening，2004(3)54-56.

［10］趙雋，王華，潘俊松，等.黃瓜子葉節(jié)離體再生體系的研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2004，22(1):43-53.ZHAO Jun，WANG Hua，PAN Junsong，et al.Study on in vitro regeneration system of Cucumber cotyledonary node［J］.Journal of Shanghai Jiao Tong University:Agricultural Sciences，2004，22(1):43-53.

［11］孫敬三，朱至清.植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.SUN Jingsan，ZHU Zhiqing.Plant cell engineering［M］.Beijing:Chemical Industry Press，2005.

［12］劉娟，湯浩茹，王小蓉，等.硝酸銀在植物離體培養(yǎng)中的應(yīng)用之研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23(10):400-406.LIU Juan，TANG Haoru，WANG Xiaorong，et al.Research progress of Silver nitrate in vitro plant culture［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2007，23(10):400-406.

［13］王麗艷，荊瑞勇，肖莉杰.扁莖黃芪離體快繁及多倍體誘導(dǎo)［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(1):94-99.WANG Liyan，JING Ruiyong，XIAO Lijie，et al.Rapid propagation in vitro and polyploid induction of Astragalus complanatus［J］.Acta Prataculturae Inica，2009，18(1):94-99.