王麗娜，王麗艷，劉景文，郭永霞*，金 勛，芮海英

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學，黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大慶分院，黑龍江 大慶 163319;3.大慶市農(nóng)業(yè)委員會，黑龍江 大慶 163319)

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)為豆科苜蓿屬多年生草本植物，是具有豐富的營養(yǎng)價值和強大生態(tài)功能的優(yōu)質(zhì)牧草，被全世界廣泛種植。然而，近年來隨著全球生態(tài)環(huán)境的日益惡化，出現(xiàn)的低溫﹑鹽漬﹑干旱等非生物脅迫環(huán)境，嚴重威脅紫花苜蓿的生長，限制了牧草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。黑龍江省鹽堿地總面積約占188萬公頃［1］，尤其西部地區(qū)的肇源﹑安達、大慶是重要的畜牧生產(chǎn)基地，也是鹽堿化較重，面積較大的區(qū)域，pH都達到了8.0以上［2］。為了保證該地域畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，還需要充分的利用和改良鹽堿地來提高牧草的生產(chǎn)率。現(xiàn)代分子生物學與基因工程技術(shù)的結(jié)合，通過向牧草中導入抗逆相關(guān)目的基因，獲得抗逆性更強的牧草新品種，對提高牧草抗逆性和產(chǎn)量有重要意義。

近年來，與植物抗逆性相關(guān)的基因核苷二磷酸激酶(NDPKs)在轉(zhuǎn)基因工程中備受關(guān)注，其是一種由數(shù)個16-20 kD多肽組成的70-100 kD的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核和真核生物中［3］，它不僅作為一種“看家酶”來維持細胞NDP和NTP的代謝平衡，而且還是一組多功能蛋白酶，參與細胞的生長和分化并與信號轉(zhuǎn)導有關(guān)，參與熱脅迫響應以及H2O2介導的氧化脅迫響應等等［4-6］。植物中 NDPKs大體上分為NDPK1，NDPK2，NDPK3三種類型，其中 NDPK2與多種脅迫響應相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)NDPK2基因的擬南芥能夠耐受－7℃低溫脅迫1 h，離體葉片耐受1 μmol·L-1甲基紫精(MV)7 d［7］;轉(zhuǎn) AtNDPK2 基因的馬鈴薯能夠耐受80 mmol·L-1NaCl脅迫及42℃高溫脅迫［8］。這些研究結(jié)果充分說明NDPK2的過量表達能夠通過調(diào)解氧化還原系統(tǒng)來提高轉(zhuǎn)基因植株對低溫、高鹽和氧化等非生物脅迫的抗性。

本研究的主要目的是將甘薯過氧化物酶啟動子(SWPA2)驅(qū)動下的AtNDPK2基因通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入紫花苜蓿受體系統(tǒng)中，建立轉(zhuǎn)化體系;利用PCR技術(shù)初步檢測出陽性植株，并對獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植株進行鹽脅迫分析，確定該基因的轉(zhuǎn)化是否增強了苜蓿植株的耐鹽性，為后期苜蓿新種質(zhì)遺傳選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿品種“敖漢”由黑龍江省畜牧研究所提供;含有目的基因AtNDPK2的植物表達載體pCAMBIA2300由韓國生命工學研究院郭尚珠教授惠贈(圖1-1A，1B)，可用于遺傳轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacferium tumefaciens)菌株EHA105由黑龍江八一農(nóng)墾大學分子實驗室建立并保存。

圖1 -1A pCAMBIA2300質(zhì)粒載體圖譜Fig.1 -1A Plasmid vector map of pCAMBIA2300

1.2 農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化及再生植株的獲得

農(nóng)桿菌EHA105經(jīng)活化后，當菌液的OD600為0.6～0.8時，侵染經(jīng)預培養(yǎng)3～5 d的下胚軸10～15 min后，轉(zhuǎn)接到含有50 mg·L-1乙酰丁香酮(AS)和2 mg·L-12，4-D+0.15 mg·L-1KT 的改良 SH 培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2～3 d，經(jīng)Cef脫菌后先轉(zhuǎn)接到僅含350 mg·L-1Cef和 2 mg·L-12，4-D+0.15 mg·L-1KT的改良SH培養(yǎng)基上進行一段時間培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接到含有350 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Kan以及0.1 mg·L-1KT改良的 SH培養(yǎng)基上誘導抗性分化芽，待抗性分化芽長至2～3 cm時隨后將其轉(zhuǎn)接到含有350 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Kan的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)生根苗，培養(yǎng)14 d左右長至2～3條根后馴化移栽。

1.3 抗性植株的分子生物學鑒定

圖1 -1B 含有AtNDPK2基因的質(zhì)粒載體Fig.1 -1B The vector structure with AtNDPK2 gene

利用CTAB法提取苜蓿植株葉片的基因組DNA，以AtNDPK2基因為模板設(shè)計一對特異性引物，上游:5'-CACCATGGTGGGAGCGACT-3'，下 游:5'-TCTGTCTAGACAAGGATCA-3'，進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL):DNA模板1 μL，上游引物(10 mmol·L-1)0.5 μL，下游引物(10 mmol·L-1)0.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)2 μL，10 ×loading buffer 2.5 μL，Taq 酶 2.5 μL。PCR 反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸8 min，4℃終止保存。電泳及凝膠成像觀察擴增出來的目的條帶的分子量大小是否在540 bp左右。

1.4 轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性分析

選取生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因苜蓿經(jīng)組織培養(yǎng)后，將獲得的組培苗轉(zhuǎn)接到含有0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0%NaCl的 1/2MS 的培養(yǎng)基中進行鹽脅迫處理，每處理重復3次(瓶)，每重復(瓶)4株，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強度2000～3000 lx，光周期時間16 h/8 h。經(jīng)3周鹽脅迫后各處理分別取樣。

1.5 各生理生化指標的測定

利用氮藍四唑法［9］和愈創(chuàng)木酚法［10］測定超氧化物酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性，利用電導儀法［9］測定質(zhì)膜透性及硫代巴比妥酸(TBA)比色法［11］測定丙二醛含量，每處理重復測定3次，取3次平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因苜蓿的獲得

通過農(nóng)桿菌EHA105(pCAMBIA2300)介導的轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因“敖漢”苜蓿23株，轉(zhuǎn)化率為23.3%。

2.2 抗性植株的PCR檢測

因AtNDPK2基因片段的擴增條件已經(jīng)很明確，所以設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，以質(zhì)粒DNA為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照。對獲得的23株抗性植株進行PCR檢測。結(jié)果有20個株系擴增出了約530 bp左右的目的片段，轉(zhuǎn)化率為86.9%(圖2-1部分結(jié)果圖片)。初步表明AtNDPK2基因已經(jīng)整合到“敖漢”苜蓿的基因組中。

2.3 鹽脅迫下苜蓿植株的生長狀況

將轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的組培苗進行擴繁后，選擇大小形態(tài)一致的再生苗進行不同濃度的鹽脅迫處理，非轉(zhuǎn)基因組培苗作為對照。發(fā)現(xiàn)NaCl濃度為0% ～0.4%處理中，兩者之間組培苗的大小形態(tài)沒有明顯的變化。隨著處理濃度增大，NaCl濃度為0.6%處理中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的葉片水浸狀、萎蔫數(shù)量明顯的少于對照，并頂部葉片處于平展狀態(tài)，而對照組葉片呈現(xiàn)水浸狀，萎蔫數(shù)量多，頂部葉片卷曲(圖2-2)。隨著鹽濃度加大和處理時間的延長對照組植株在NaCl濃度≧0.6%逐漸黃化死亡，轉(zhuǎn)基因組培苗葉片呈現(xiàn)水浸、萎蔫、卷曲的數(shù)量隨濃度升高而增多，在NaCl濃度達到1.0%處理中沒有死亡現(xiàn)象發(fā)生。由此說明了AtNDPK2基因的轉(zhuǎn)化增強了苜蓿應對高鹽濃度的耐受性，葉片受脅迫響應出現(xiàn)癥狀明顯。

2.4 鹽脅迫下相對電導率和丙二醛(MDA)含量變化

轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株在0%～0.2%NaCl處理濃度下，細胞內(nèi)電解質(zhì)相對滲出率較低，兩者之間相對電導率沒有明顯的差異。隨著鹽濃度的升高非轉(zhuǎn)基因植株質(zhì)膜相對電導率顯著增大，而轉(zhuǎn)基因植株相比于0% ～0.2%NaCl處理增大的幅度不明顯，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因植株的相對電導率相比較非轉(zhuǎn)基因植株顯著降低最后趨于平穩(wěn)。在非轉(zhuǎn)基因植株中丙二醛含量的變化趨勢為隨著鹽處理濃度的升高，丙二醛含量是逐漸升高的，而轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量在0.2%NaCl處理下與非轉(zhuǎn)基因植株沒有顯著的差異，當鹽濃度＞0.2%時，轉(zhuǎn)基因植株相比較非轉(zhuǎn)基因植株丙二醛含量明顯降低，與非轉(zhuǎn)基因植株呈顯著性的差異，隨著鹽處理濃度的增大轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量趨于平穩(wěn)(圖2-3)。電解質(zhì)相對電導率和丙二醛含量是衡量植物質(zhì)膜完整性和膜質(zhì)過氧化程度的標準，該結(jié)果表明高鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株細胞膜受傷害小，細胞膜完整性較好，膜質(zhì)的過氧化程度低，植株遭受損害輕，NDPK2基因的過量表達提高了植株的耐鹽性。

2.5 鹽脅迫下超氧化物酶(SOD)活性變化

轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株在0%～0.2%鹽脅鹽脅迫下維持正常生理活動，提高植株耐鹽能力。

圖2-1 轉(zhuǎn)AtNDPK2植株的基因組DNA提取及PCR擴增的目的基因Fig.2-1 Genomic DNA extracted of AtNDPK2 and the target gene of PCR amplifing

圖2-2 鹽脅迫下非轉(zhuǎn)基因植株(A)，轉(zhuǎn)基因植株(B)的表現(xiàn)形態(tài)Fig.2-2 The performance of non-transgenic plant(A)，transgenic plant(B)under salt stress

2.6 鹽脅迫下過氧化物酶(POD)活性變化

圖2-3 鹽脅迫下植株相對電導率(%)和丙二醛含量(%)的變化Fig.2-3 The changes relative elecrtrical conductivity(%)and MDA(%)of plant under salt stress

非轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因植株在不同的鹽濃度下POD的活性變化各不相同，當NaCl濃度達到0.4%時非轉(zhuǎn)基因植株的POD活性達到最大值，隨著鹽濃度的不斷增加，非轉(zhuǎn)基因植株P(guān)OD活性不斷下降;而轉(zhuǎn)基因植株的POD活性一直維持在較高水平。POD也是一種植物細胞內(nèi)的保護性酶，不僅與植物抵御不良環(huán)境條件有關(guān)，而且它還與植物抵御各種病害和環(huán)境中某些營養(yǎng)元素脅迫以及植物抗衰老有關(guān)。大部分試驗證明，POD活性越高，植株的抗逆性越強。該迫條件下超氧化物酶(SOD)的活性都沒有發(fā)生明顯的變化，當鹽處理濃度≥0.4%的時，兩者的SOD酶活性顯著增高。隨鹽濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因植株SOD活性呈現(xiàn)出降低的趨勢，當NaCl濃度為1.0%時SOD酶活性最低;而轉(zhuǎn)基因植株SOD活性則呈現(xiàn)出不斷升高，SOD活性顯著的高于非轉(zhuǎn)基因植株，并隨鹽濃度增大而趨于平穩(wěn)(圖2-4)。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的保護酶，能夠有效清除因脅迫或損傷造成的細胞產(chǎn)生大量自由基或過氧化物，使它們維持較低水平，避免細胞結(jié)構(gòu)受到危害。該結(jié)果說明了SOD活性越高越有利于轉(zhuǎn)基因植株在結(jié)果說明了POD酶活性越高，植株細胞損傷程度越小，從而提高了苜蓿的耐鹽性。

3 討論

近年來，對于紫花苜蓿植株的遺傳轉(zhuǎn)化研究比較廣泛，轉(zhuǎn)化的基因類型主要包括品質(zhì)改良，抗病、蟲害，抗除草劑，抗逆相關(guān)基因以及作為生物反應器等［12］。其中對于抗逆基因的轉(zhuǎn)化研究比較深入。大多數(shù)研究結(jié)果表明植株的抗逆性往往是受多基因控制的，單一功能基因的導入，并不能達到預期的效果。本實驗選用甘薯過氧化物酶啟動子(SWPA2)，SWPA2是一種較強的脅迫誘導型啟動子，更加適用于培育耐環(huán)境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物研究［13，14］。NDPK2又是一種促進多種抗氧化酶表達的抗逆基因［15］。兩者組合達到了提高抗逆性的雙重功效，這將對增強苜蓿轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性具有重要意義。

圖2-4 鹽脅迫下植株超氧化物酶(SOD)活性變化Fig.2-4 The changes SOD activity of plant under salt stress

圖2-5 鹽脅迫下植株過氧化物酶(POD)活性變化Fig.2-5 The changes POD activity of plant under salt stress

基因的轉(zhuǎn)化是否增強了植株的耐鹽性，需要對轉(zhuǎn)基因植株進行了耐鹽性驗證。研究結(jié)果顯示當轉(zhuǎn)基因植株受到0.4% ～1.0%NaCl脅迫時，SOD、POD活性上升，非轉(zhuǎn)基因植株的SOD、POD也在逐漸上升只是兩者的活性表現(xiàn)上升幅度不同，轉(zhuǎn)基因植株酶活性始終高于非轉(zhuǎn)基因植株。當NaCl濃度0.6%脅迫7 d時發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)了葉片呈現(xiàn)水浸、卷曲、萎蔫癥狀，而轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)不明顯。SOD，POD是清除活性氧自由基的關(guān)鍵酶［16，17］，在氧化脅迫反應早期起主要調(diào)節(jié)作用［18］，所以該生理生化指標可用來衡量植株的耐鹽性。轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株質(zhì)膜相對電導率及丙二醛含量也表現(xiàn)出顯著性差異，隨著鹽濃度的增加，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的相對電導率及丙二醛含量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株，而非轉(zhuǎn)基因植株相對電導率及丙二醛含量呈現(xiàn)上升趨勢。相對電導率變化可反映質(zhì)膜的破壞程度及植株的抗逆性強弱［19-21］，丙二醛含量變化也可反映植物遭受逆境傷害的程度［22］。該試驗獲得的結(jié)果充分說明在高濃度鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系膜脂質(zhì)過氧化程度低，膜結(jié)構(gòu)受到的傷害較小，質(zhì)膜的選擇透性強，植株受損程度小，進一步證實了AtNDPK2基因的轉(zhuǎn)入提高了轉(zhuǎn)基因“敖漢”苜蓿的耐鹽性。農(nóng)桿菌EHA105菌株介導轉(zhuǎn)化SWPA2啟動子驅(qū)動的AtNDPK2基因增強了“敖漢”苜蓿植株的耐鹽性。

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