尹 青 趙新新 閆鑫磊 劉賢勇 索 勛

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

剛地弓形蟲Toxoplasmagondii是一種人畜共患的專性細胞內(nèi)寄生原蟲，可引起世界范圍內(nèi)廣泛流行的寄生蟲病。據(jù)估計，全球約三分之一的人口受到該寄生蟲的感染(Montoyaetal., 2004；Weissetal.,2009)。弓形蟲是一種機會性致病寄生蟲，主要危害孕婦及免疫系統(tǒng)低下的人群，免疫功能正常的人感染并不引起明顯的臨床癥狀(Tenteretal.,2000；Weissetal., 2009)。

系統(tǒng)性免疫應答又稱全身性免疫應答，是與局部性免疫應答相對的一個概念。局部性黏膜免疫部位主要包括腸道、呼吸道、泌尿生殖道等反應部位(Chardesetal., 1993；Tuyishimeetal., 2014)。經(jīng)口食入含有弓形蟲包囊及卵囊的食物及飲水是動物及人感染弓形蟲的兩個最主要途徑(Dubey, 1997)。緩殖子或子孢子到達腸道后，入侵宿主腸壁細胞并經(jīng)血液或淋巴循環(huán)分布到全身各器官組織中寄生。在這個過程中，弓形蟲激發(fā)宿主產(chǎn)生腸道黏膜免疫及系統(tǒng)性免疫應答(Denkersetal., 1998)?，F(xiàn)在大部分研究都將抗弓形蟲感染集中于腸道黏膜免疫反應，認為局部的免疫反應可以阻擋弓形蟲入侵從而破壞其對宿主的感染(Chardesetal., 1993；Cruzetal., 2014)。但是越來越多的研究表明，在弓形蟲感染中，系統(tǒng)性免疫應答也起著十分重要的作用(Gazzinellietal., 1991；Gigleyetal., 2009; Wangetal., 2014)。

本研究用BALB/c小鼠口服感染Pru株弓形蟲包囊，然后對組織包囊進行觀察以確認慢性感染，從而建立弓形蟲慢性感染小鼠模型。通過檢測該小鼠的系統(tǒng)性T細胞免疫應答規(guī)律，初步探討機體慢性感染弓形蟲后的系統(tǒng)性免疫應答抵抗機制。

1 材料與方法

1.1 蟲株及實驗動物

本研究所用的弓形蟲蟲株為Prugniaud(Pru)蟲株，由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所朱興全教授惠贈。在昆明鼠上完成該蟲株的傳代保種，在人包皮成纖維細胞 (HFF)細胞中完成該蟲株的速殖子擴增。本研究使用的清潔級雌性BALB/c小鼠(體重18～24 g，6～8周齡)購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 小鼠腦內(nèi)包囊的檢測

每只小鼠口服感染Pru株4個包囊，45 d后，無菌條件下取小鼠大腦，用預冷的PBS沖洗表面殘留的血液，然后在無菌的勻漿器中對腦組織進行勻漿，顯微鏡下觀察。

1.3 弓形蟲包囊的純化與染色

將小鼠腦勻漿液加適量PBS稀釋。取一支無菌的15 mL離心管，先加入6 mL小鼠淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)，再將等體積的腦勻漿液輕輕地加到淋巴細胞分離液液面上。3 500 r/min，室溫離心30 min。小心棄掉所有液體，只留下緊貼在管底的沉淀。用適量PBS重懸沉淀后，進行鏡檢。

離心并收集沉淀，4 ℃條件下，用預冷的500 μL多聚甲醛固定30 min，離心棄上清，將沉淀加入適量結(jié)晶紫染色液染色20 min，洗滌2次后鏡檢觀察。

1.4 弓形蟲超聲抗原的制備及含量測定

收集在HFF細胞上的弓形蟲速殖子，用PBS洗滌兩遍，將收集到的速殖子用孔徑5 μm的濾器進行過濾。室溫下，3500 r/min將濾液離心30 min，收集蟲體，用超聲波細胞破碎儀(功率30%)將弓形蟲裂解10 min。取上清，用蛋白定量檢測試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)對蛋白含量進行檢測。

1.5 小鼠脾細胞胞內(nèi)細胞因子染色

無菌取小鼠脾細胞，研磨成單個細胞，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞。用預冷PBS將細胞洗滌兩遍。每孔5×106細胞，加入12孔板中。將弓形蟲全蟲抗原加入細胞中(終濃度為24 μg/mL)，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。16 h后，在陽性孔每孔加入5 ng/mL PMA和500 ng/mL離子霉素(Sigma)；所有孔中加入0.75 μL 蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(BD Biosciences)。6 h后進行胞內(nèi)細胞因子染色。首先，在4 ℃條件下，用抗小鼠CD16/CD32抗體(Biolegend)封閉30 min。洗滌細胞，加入如下熒光標記的抗小鼠單抗FITC-CD3，PE-CD4，APC-CD8 (Biolegend)，4 ℃避光反應30 min。洗滌細胞，加入250 μL 固定穿膜液(BD Biosciences)，懸浮細胞，4 ℃避光反應20 min。然后，用Perm/Wash buffer(BD Biosciences)洗滌細胞，加入50 μL Perm/Wash buffer，懸浮細胞，向其中加入Percp/cy5.5-IFN-γ單抗(Biolegend)，4 ℃避光反應30 min。洗滌細胞，流式細胞儀檢測。

1.6 WST-8法檢測T細胞增殖

將1.5中計數(shù)后獲得的小鼠脾細胞以3×106/mL懸于完全RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于96孔細胞板中，每孔100 μL，每只小鼠9個孔：3孔為未刺激細胞，3孔為弓形蟲抗原刺激細胞(終濃度為24 μg/mL)，剩余的為ConA刺激孔(終濃度為5 μg/mL)；同時設立培養(yǎng)基對照組。37 ℃，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，顯微鏡下觀察并在每孔加入10 μL WST-8，輕輕振蕩后置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。然后用酶標儀測定450 nm下的OD值。最后進行計算，刺激指數(shù)(SI)=(各刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)/ (未刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)。

1.7 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0的一般線性模型(GLM)過程的one-way ANOVA程序分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲慢性感染BALB/c小鼠的鑒定

如圖1所示，在未感染弓形蟲的組內(nèi)，3只小鼠(C1，C2，C3)腦內(nèi)未發(fā)現(xiàn)包囊；而在感染弓形蟲的小鼠(T1，T2，T3)腦內(nèi)都能檢出弓形蟲包囊。

包囊經(jīng)純化后，鏡下可以觀察到包囊受蓋玻片擠壓破裂而釋放出的弓形蟲緩殖子，見圖2-A，可見游離出的單個的緩殖子。將純化后的包囊進行染色，整個包囊及緩殖子(圖2-B)都被染成藍紫色。

2.2 弓形蟲慢性感染小鼠脾臟T細胞在抗原刺激下可以產(chǎn)生明顯增殖

如圖3-B、3-C所示，弓形蟲慢性感染小鼠脾臟細胞受抗原及ConA刺激72 h后，淋巴細胞發(fā)生增殖，出現(xiàn)單克隆細胞群體；而未加抗原刺激組未發(fā)生細胞增殖(圖3-A)。如圖3-D所示，未感染小鼠脾臟抗原刺激指數(shù)為1.01～1.61；而慢性感染小鼠脾臟抗原刺激指數(shù)為5.14～9.40，兩組之間有顯著差異。

圖1 弓形蟲慢性感染BALB/c小鼠腦內(nèi)包囊的觀察Fig. 1 T. gondii cysts in the brain homogenate of chronically infected BALB/c miceC1、C2、C3：3只陰性對照小鼠的腦勻漿；T1、T2、T3：3只弓形蟲慢性感染小鼠的腦勻漿。C1, C2 and C3 represent brain homogenate of negative control mice; while T1, T2 and T3 represent brain homogenate of chronically infected mice.

圖2 慢性感染小鼠腦包囊及緩殖子的觀察Fig. 2 Purified T. gondii cysts and bradyzoites from the chronically infected mice A. 腦內(nèi)包囊經(jīng)淋巴細胞分離液純化后，包囊受外力擠壓而發(fā)生破裂，大量緩殖子釋放出來。B. 為純化的包囊經(jīng)固定及結(jié)晶紫染色后，可見整個包囊及受擠壓而釋放出的緩殖子都被染成藍紫色。標尺代表50 μm。A. A brain cyst mechanically ruptured to release a large number of bradyzoites through a hole in cyst wall. B. A brain cyst and released bradyzoites were all stained with crystal violet solution. Bar represents 50 μm.

圖3 弓形蟲慢性感染小鼠的脾臟細胞受抗原刺激后的增殖反應Fig. 3 Lymphocytes proliferation post stimulation by T. gondii antigen弓形蟲慢性感染小鼠的脾臟受抗原刺激72 h后，未加抗原組(A)、抗原刺激組(B)、以及陽性對照組(C)鏡下觀察的結(jié)果; D顯示的是將未感染小鼠及感染小鼠脾臟細胞受抗原刺激96 h后增殖結(jié)果。** 表示P<0.01。Lymphocytes proliferation of the chronically infected mice stimulated for 72 h， Negative group (A), Antigen stimulated group (B) and Positive group (C); D represents the results of the lymphocytes proliferation from the control group and the infected group after stimulation for 96 h. ** P<0.01.

2.3 慢性感染小鼠T細胞體外抗原刺激后可以產(chǎn)生特異性IFN-γ

如圖4-A、圖4-C所示，受抗原刺激后，未感染小鼠脾臟IFN-γ+CD3+、IFN-γ+CD4+、IFN-γ+CD8+占CD3+、CD4+、CD8+的比例分別為0.63%、0.33%、0.23%；如圖4-B、圖4-D所示，感染小鼠脾臟IFN-γ+CD3+、IFN-γ+CD4+、IFN-γ+CD8+占CD3+、CD4+、CD8+的比例分別為2.03%、1.33%、0.93%。

圖4 特異性T細胞受抗原刺激產(chǎn)生IFN-γ的檢測Fig. 4 IFN-γ released from the T. gondii-specific T cells after stimulation in vitroA、C顯示的是陰性對照組小鼠脾臟細胞受弓形蟲抗原刺激后，利用胞內(nèi)細胞因子染色的方法對特異性T細胞分泌IFN-γ情況進行檢測，A顯示的是流式散點圖，C顯示的統(tǒng)計結(jié)果；B、D顯示的是弓形蟲慢性感染小鼠的脾臟細胞受弓形蟲抗原刺激后，特異性T細胞分泌IFN-γ情況，B顯示的是流式散點圖，D顯示的統(tǒng)計結(jié)果。0為未加抗原刺激組，Ag為加抗原刺激組，PMA為陽性對照組。圖中所有數(shù)值為檢測3只小鼠后所得的平均值。After stimulation with T. gondii antigen in vitro, IFN-γ was detected in CD3+, CD4+, CD8+T cells by flow cytometry. A and C represent results of control group; B and D represent results of infected group. A and B represent flow cytometry plots of IFN-γ+ CD3+T, IFN-γ+ CD4+T, IFN-γ+ CD8+T cells. C and D represent percent of IFN-γ+ cells in CD3+, CD4+, CD8+T cells respectively. 0 represent no stimulation group; Ag, T. gondii antigen stimulated group; PMA, positive group. Data were derived from 3 mice per group analyzed with their average value.

3 討論

本研究將BALB/c小鼠口服感染弓形蟲Pru株包囊，通過鏡檢，確認包囊的存在，表明成功建立了弓形蟲慢性感染小鼠模型。通過對該小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲慢性感染小鼠脾細胞在體外弓形蟲抗原條件下，產(chǎn)生特異性細胞增殖，且脾臟特異性T細胞可以產(chǎn)生IFN-γ。上述結(jié)果表明，弓形蟲慢性感染的BALB/c小鼠可以產(chǎn)生顯著的系統(tǒng)性T細胞免疫應答。

系統(tǒng)性免疫應答在抵抗弓形蟲感染過程中起著越來越重要的作用。在弓形蟲疫苗的研究過程中，發(fā)現(xiàn)弱毒蟲株可以激發(fā)宿主產(chǎn)生很好的免疫保護反應，主要是因為弱毒疫苗可以在體內(nèi)擴散，激發(fā)很好的系統(tǒng)性免疫應答(McLeodetal., 1984)。用對溫度敏感的ts-4株弓形蟲腹腔免疫小鼠，ELISPOT檢測發(fā)現(xiàn)免疫后小鼠的脾細胞可以產(chǎn)生特異性IFN-γ，并可以有效保護小鼠抵抗RH強毒株的攻擊(Gazzinellietal., 1991)。上述證據(jù)表明在弓形蟲疫苗的研制過程中，系統(tǒng)性T細胞免疫應答對疫苗的保護效果具有至關重要的作用。

IFN-γ在抵抗弓形蟲急性感染及慢性感染中都起到關鍵作用(Suzukietal., 1988；Gazzinellietal., 1991)。研究表明，在慢性感染中，IFN-γ的產(chǎn)生需要CD4+和CD8+T細胞協(xié)同作用才能完成，二者缺一不可(Gazzinellietal., 1992)。BALB/c小鼠腹腔免疫γ射線處理過的Pru速殖子，體外抗原刺激后發(fā)現(xiàn)，IFN-γ+CD4+及IFN-γ+CD8+所占CD4+及CD8+亞群比例與本研究基本一致(Blanchardetal., 2008)，這表明，Pru株弓形蟲是一株免疫原性很好的蟲株，不同的免疫途徑、蟲體階段都可以使小鼠產(chǎn)生相似的系統(tǒng)性免疫應答。感染28 d后的小鼠脾臟細胞才能出現(xiàn)明顯增殖(Chardesetal., 1993)。本研究取感染45 d后的小鼠脾臟，發(fā)現(xiàn)細胞增殖與未感染組出現(xiàn)明顯差異，這與前人的研究結(jié)論一致。但在感染兩周左右時，細胞的增殖仍不明顯(數(shù)據(jù)未顯示)，可能原因是，口服感染弓形蟲包囊7～15 d后的小鼠脾臟中很少發(fā)現(xiàn)蟲體，導致抗原在該時間段內(nèi)不能有效激活系統(tǒng)性免疫應答，但隨著蟲體快速增殖，蟲體散播至全身各組織器官，系統(tǒng)性免疫被有效激活，四周后(即28 d左右)記憶細胞大量形成后出現(xiàn)明顯的細胞增殖(Chardesetal., 1993)。

本研究將Pru株弓形蟲模擬弱毒疫苗株免疫(或感染)BALB/c小鼠。成功構(gòu)建了弓形蟲慢性感染小鼠模型。慢性感染小鼠可以產(chǎn)生針對弓形蟲的特異性、系統(tǒng)性T細胞免疫應答，這將為弓形蟲弱毒疫苗研制的效果評價提供參考依據(jù)。