俞富祥， 朱千東， 余正平， 張啟瑜

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科，浙江溫州325000)

肝纖維化是各類慢性肝病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)。其中25%～40%最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，是一類世界性的嚴(yán)重危害人們健康的主要疾病。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。HSCs增殖激活后可分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，引起膠原纖維沉積導(dǎo)致纖維化。阻止HSCs的增殖活化有可能阻斷肝纖維化和肝硬化的進(jìn)程［1-3］。辣椒素是辣椒中的主要辛辣成分，近年來的研究成果顯示其具有止痛、降脂減肥及抗癌等［4-6］多種藥理活性。作者前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)較低濃度的辣椒素能抑制HSCs增殖，誘導(dǎo)HSCs凋亡，本研究繼續(xù)探討辣椒素對HSCs活性的影響及纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，探討辣椒素能否用于治療肝纖維化及其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料及試劑

SD大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供;HSCT6細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫;辣椒素購自Sigma;CCK-8購自日本同仁化學(xué)公司;DMEM和胎牛血清購自 Gibco，Bcl-2、Bax、Cyt-C 等Ⅰ抗購自 CST;Annexin V/PI apoptosis kit購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司;全自動酶標(biāo)儀(Bio-Rad);FACS流式細(xì)胞儀(BD)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HSCs接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每2～3 d換液1次。

2.2 DCFH-DA法檢測HSCs中活性氧的水平 收集對數(shù)期細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋成細(xì)胞懸液，加入96孔板，每孔100 μL，含細(xì)胞 5×104個，加入辣椒素(0、50、100、150 和200 μmol/L)，培養(yǎng)24 h 后吸去上清液，加入用 DMEM培養(yǎng)液稀釋好的10 μmol/L DCFH-DA溶液，置孵箱孵育0.5 h，用DMEM培養(yǎng)液洗2遍后熒光顯微鏡下觀察熒光亮度。

2.3 CCK-8比色法檢測HSCs增殖 96孔板每孔培養(yǎng)細(xì)胞5×104，培養(yǎng)24 h后按不同濃度分別向各孔中加入辣椒素 (0、50、100、150 和200 μmol/L)，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)液中辣椒素0 mg/L的HSCs為空白對照組。培養(yǎng)24 h后每孔加入CCK-8溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用自動酶標(biāo)儀于450 nm處檢測每孔的吸光度(A)值，間接計算細(xì)胞增殖程度。

2.4 Western blotting法檢測HSCs中α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá) 按前述方法分組加入不同濃度辣椒素，培養(yǎng)48 h后，在各培養(yǎng)體系HSCs中分別加入現(xiàn)配的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。取一定量蛋白樣品上樣。SDSPAGE膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉緩沖液室溫?fù)u床振蕩1 h，加入α-SMA抗體 (1∶100)，4℃過夜，TBST 漂洗3次，10 min/次，孵育Ⅱ抗(1∶30 000)，37 ℃恒溫振搖1 h;TBST漂洗3次，10 min/次，化學(xué)發(fā)光，顯影、定影，對膠片圖像掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Gel-Pro Analyzer分析目標(biāo)帶的灰度值。

2.5 RT-PCR法檢查HSCs肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)

按前述方法根據(jù)不同辣椒素濃度分組，HSCs培養(yǎng)24 h，由長風(fēng)生物科技公司設(shè)計大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 1，MMP-1)、金屬蛋白酶組織抑制物 1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)及內(nèi)參照 GAPDH 的引物，利用 RT-PCR技術(shù)，分別測定各組細(xì)胞中上述基因的mRNA表達(dá)情況。具體如下:MMP-1上游引物 5′-CTCCCTTGGACTCACTCATTCTA-3′，下 游 引 物 5′-AGAACATCACCTCTCCCCTAAAC-3′，擴(kuò)增片段長 227 bp;TIMP-1 上游引物 5′-CCTCTGGCATCCTCTTGTTG-3′，下游引物 5′-CGCTGGTATAAGGTGGTCTC-3′，擴(kuò)增片段長157 bp;TGF-β1上游引物:5′-GAGGCGGTGCTCGCTTTGT-3′，下游 引 物 5′-CGGGTGACTTCTTTGGCGTAG-3′，擴(kuò)增片段長 107 bp;GAPDH 上游引物 5′-GAGGACCAGGTTGTCTCCTG-3′，下游引物 5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3′，擴(kuò)增片段長 215 bp;用GAPDH為內(nèi)參照，分別擴(kuò)增MMP-1、TIMP-1和TGF-β1。反應(yīng)條件為:94℃ 5 min預(yù)變性，擴(kuò)增40個循環(huán)，每個循環(huán)包括:94℃ 30 s，52.1℃ 30 s，72℃45 s。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測HSCs凋亡 按前述方法根據(jù)不同濃度辣椒素濃度分組，HSCs在6孔板中作用24 h后，用不含EDTA的胰酶消化，每個樣本收集約2×105個細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，1 500 r/min離心5 min，加入 200 μL binding buffer重懸細(xì)胞;加入5 μL annexin V-FITC 混勻后，再加入 5 μL propidium iodide，混勻;室溫、避光反應(yīng)20 min后上機(jī)檢測，流式細(xì)胞儀激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

2.7 肝臟組織病理學(xué)檢查 選擇體質(zhì)量250～300 g的SD大鼠，采用50%四氯化碳植物油溶液腹腔注射3個月，獲得肝纖維化模型。將不同劑量辣椒素(0、2.5、5.0、7.5 mg/kg)分別腹腔注射肝纖維化大鼠，將正常大鼠及注射5.0 mg/kg辣椒素的正常大鼠設(shè)為正常對照及陰性對照組，每組大鼠5只，每周注射2次，共4周，最后1次注射后繼續(xù)飼養(yǎng)1周。處死大鼠，取肝行石蠟切片和HE、α-SMA染色。

2.8 肝組織羥脯氨酸和血清III前膠原肽及透明質(zhì)酸測定 使用肝羥脯氨酸試劑盒測定肝臟膠原含量。肝組織(80 mg)在冰凍條件下勻漿，勻漿液經(jīng)37℃孵育消化過夜后，勻漿液離心復(fù)溶于測試液中，勻漿液中的羥脯氨酸在550 nm波長測定A值，由已知羥脯氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的A值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測試液的A值計算出肝組織內(nèi)的羥脯氨酸濃度。按試劑盒說明采用放射免疫法測定大鼠血清Ⅲ型膠原和透明質(zhì)酸水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗。多個樣本均數(shù)間的比較用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 辣椒素抑制HSCs中活性氧的產(chǎn)生

熒光顯微鏡觀察可見，與對照組比較，隨著培養(yǎng)液中辣椒素濃度的增加，HSCs中活性氧的產(chǎn)生呈明顯遞減趨勢，見圖1。

Figure 1.The reactive oxygen species in HSCs treated with capsaicin at different concentrations(×100).A:0 μmol/L;B:50 μmol/L;C:100 μmol/L;D:150 μmol/L;E:200 μmol/L.圖1 熒光法檢測各培養(yǎng)體系HSCs中活性氧的生成

2 辣椒素抑制了HSCs的增殖

與對照組相比，隨著培養(yǎng)液中辣椒素濃度增加，HSCs增殖程度明顯下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各培養(yǎng)體系中HSCs的細(xì)胞增殖程度的比較Table 1.The effect of capsaicin on the proliferation of activatedHSCs(Mean±SD.n=5)

3 辣椒素抑制HSCs中α-SMA的表達(dá)

Western blotting法檢測可見，隨著培養(yǎng)液中辣椒素濃度增加，與對照組相比較，HSCs中的α-SMA表達(dá)水平明顯下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The effect of capsaicin on α-SMA expression in activated HSCs.A:0 μmol/L;B:50 μmol/L;C:100 μmol/L;D:150 μmol/L;E:200 μmol/L.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs A group or B group.圖2 各培養(yǎng)體系中HSCs的α-SMA表達(dá)

4 辣椒素調(diào)節(jié)HSCs中MMP-1、TIMP-1和TGF-β1mRNA的表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果表明，與對照組相比，隨著培養(yǎng)液中辣椒素濃度增加，HSCs中MMP-1 mRNA表達(dá)未見明顯變化 (P＞0.05)，但 TIMP-1及 TGF-β1mRNA卻呈降低趨勢，差別有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，見圖 3。

Figure 3. The effects of capsaicin on MMP-1，TGF-β1and TIMP-1 mRNA expression in activated HSCs.A:0 μmol/L;B:50 μmol/L;C:100 μmol/L;D:150 μmol/L;E:200 μmol/L.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs A group or B group.圖3 各培養(yǎng)體系中 HSCs MMP-1、TGF-β1及 TIMP-1 mRNA的表達(dá)

5 辣椒素促進(jìn)了HSCs的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著培養(yǎng)液中辣椒素濃度增加，HSCs的凋亡率逐步升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The effect of capsaicin on apoptosis of activated HSCs.A:0 μmol/L;B:50 μmol/L;C:100 μmol/L;D:150 μmol/L;E:200 μmol/L.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs A group or B group.圖4 各培養(yǎng)體系中HSCs的凋亡情況

6 肝纖維化模型鼠肝臟組織病理學(xué)的改變

肝臟病理切片HE染色檢查發(fā)現(xiàn)，肝纖維化模型大鼠肝臟肝細(xì)胞呈片狀壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，纖維間隔形成。隨著辣椒素注射液劑量的增加，肝細(xì)胞變性壞死逐漸減輕，纖維間隔變窄，肝小葉結(jié)構(gòu)殘留增多，肝臟纖維化程度減輕，而陰性對照組肝臟病理未見明顯變化，見圖5。肝臟病理切片α-SMA染色檢查發(fā)現(xiàn)，隨著辣椒素注射液劑量的增加，肝纖維化模型大鼠肝組織中α-SMA表達(dá)量逐漸降低，見圖6。

Figure 5.The effect of capsaicin on pathologic changes of the liver tissues in vivo(HE staining，×100).A:0 mg/kg;B:2.5 mg/kg;C:5.0 mg/kg;D:7.5 mg/kg;E:normal control group(normal rats);F:negative control group(normal rats treated with 5.0 mg/kg capsaicin).圖5 各組大鼠肝臟病理切片HE染色

7 肝組織羥脯氨酸含量及血清Ⅲ型膠原和透明質(zhì)酸水平的變化

檢測結(jié)果顯示，隨著辣椒素注射液濃度的增加，肝組織羥脯氨酸含量及血清Ⅲ型膠原和透明質(zhì)酸水平均呈逐漸降低趨勢，各組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見表2。

Figure 6.The effect of capsaicin on α-SMA expression in the liver tissues in vivo(immunohistochemical staining，×100).A:0 mg/kg;B:2.5 mg/kg;C:5.0 mg/kg;D:7.5 mg/kg.圖6 各組大鼠肝臟病理切片α-SMA免疫組化染色

表2 各組大鼠肝臟膠原纖維蛋白及血漿纖維化水平Table 2.The effects of capsaicin on the hydroxyproline expression in the liver tissues，and the serum levels of collagen III and hyaluronic acid in the rats with liver fibrogenesis(Mean±SD.n=5)

討 論

我國是肝炎高發(fā)國家，肝炎遷延不愈最終發(fā)展成肝硬化，由肝硬化導(dǎo)致的肝功能衰竭或肝癌是引起患者死亡的主要原因，嚴(yán)重影響人民的健康。因此，阻斷或延緩肝纖維化的發(fā)展是目前研究治療肝硬化的關(guān)鍵。HSCs屬于肝臟的間質(zhì)細(xì)胞，它在肝纖維化過程中扮演著重要的角色。針對HSCs的治療是預(yù)防和治療肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7-9］。

辣椒素是辣椒中的主要辛辣成分。辣椒素在各種辣椒中含量從0.5%～1%不等。辣椒素具有多種藥理活性，既往對辣椒素的研究主要集中于抗炎、抗氧化、止痛、抗腫瘤等的作用［10-11］，而辣椒素與HSCs的活化增殖及辣椒素與肝纖維化的關(guān)系研究則未見相關(guān)報道。

辣椒素具有抗氧化特性，它能清除自由基，終止自由基造成的脂質(zhì)過氧化，有效抑制活性氧誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，本實驗結(jié)果顯示，辣椒素的抗氧化作用可抑制HSCs活化增殖過程中活性氧的產(chǎn)生，從而參與抑制HSCs的活化與增殖過程。

HSCs活化后MMP-1表達(dá)降低而TIMP-1和TGF表達(dá)升高，升高的TIMP-1和TGF-β1反過來又可促進(jìn)HSCs活化及纖維化基質(zhì)的分泌，從而促進(jìn)肝纖維化［8］。而本實驗顯示，盡管辣椒素對HSCs的MMP-1表達(dá)無明顯影響，但辣椒素抑制HSCs的增殖活化，而且抑制HSCs的TIMP-1和TGF-β1表達(dá)，綜合以上效應(yīng)，我們認(rèn)為辣椒素在減輕肝纖維化方面可能具有一定的療效。

我們通過四氯化碳誘導(dǎo)建立的大鼠肝纖維化模型，經(jīng)腹腔注射辣椒素的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素確實能在一定程度上有效抑制肝纖維化進(jìn)程。對于辣椒素在體內(nèi)如何起到抗肝纖維化作用，我們推測一定濃度的辣椒素可能通過抑制HSCs的增殖激活，促進(jìn)其凋亡，而且抑制促纖維化基因TIMP-1與TGF-β1的表達(dá)，減緩了四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化進(jìn)程。

根據(jù)目前初步研究的結(jié)果顯示，辣椒素可通過抑制HSCs的活性而發(fā)揮抗纖維化作用。但我們在研究中也發(fā)現(xiàn)辣椒素不僅可引起HSCs的凋亡，而且也可引起正常肝細(xì)胞的凋亡，只是肝細(xì)胞損傷變性程度較HSCs輕而已，因此，對辣椒素的活體研究有待進(jìn)一步深入。

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