陸 英， 張祥忠， 丁 倩， 朱小玉， 陳運賢

(中山大學附屬第三醫(yī)院 1血液科，2輸血科，3血液病研究所，廣東 廣州510630;4貴州省人民醫(yī)院血液科，

貴州貴陽550002;5安徽省立醫(yī)院血液科，安徽合肥230001;6中山大學附屬第一醫(yī)院血液科，廣東廣州510080)

慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種發(fā)生在造血干細胞的惡性骨髓增殖性疾病，其發(fā)病率為1/105～2/105。CML的特征性細胞遺傳學改變?yōu)閠(9;22)形成Ph染色體，由此形成的Bcr/Abl融合基因是其發(fā)病的分子機制。2001年美國FDA批準了第1個Bcr/Abl酪氨酸激酶抑制劑——伊馬替尼(imatinib，STI571)治療CML取得良好臨床療效，然而隨著用藥時間的累積，耐藥成為了一個新問題。因此，開發(fā)新一代酪氨酸激酶抑制劑或者探求其它不同作用機制的抗腫瘤藥物成為研究熱點。近年來的研究表明組蛋白脫乙酰酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACI)可誘導多種腫瘤細胞生長阻滯、分化及凋亡［1-2］。丙戊酸(valproate，VPA)是一種傳統(tǒng)的抗癲癇藥物，同時也表現(xiàn)出很強的 HDACI活性。本實驗觀察 VPA聯(lián)合STI571對K562細胞增殖的抑制作用及其可能機制，為VPA應用于CML的治療探索新的思路。

材料和方法

1 主要試劑

VPA購自法國賽諾菲安萬特公司，STI571購自瑞士諾華公司。RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品，胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購自杭州四季青生物公司，細胞周期分析試劑盒為 Becton Dickinson產(chǎn)品，Annexin/PI凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，Trizol購自Invitrogen，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas，Taq DNA聚合酶購自 Fermentas。PCR引物及探針由Invitrogen合成?？沟鞍准っ窧(protein kinase B，PKB)單克隆抗體、抗磷酸化PKB(p-PKB)單克隆抗體以及抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology，羊抗兔IgG和兔抗鼠IgG購自Santa Cruz。

2 細胞和細胞培養(yǎng)

K562細胞株由中山大學腫瘤研究所贈送。K562細胞株用含10%FCS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔2～3 d換液1次。

3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

取對數(shù)生長期的K562細胞以5×109cells/L種于6孔板中，設(shè)立對照組、VPA組和 VPA聯(lián)合STI571組，加藥48 h后，收集各組細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered solution，PBS)洗2次，離心棄上清，70%冷乙醇4℃固定過夜后，離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min，400目篩網(wǎng)過濾1次，再離心5 min，棄去PBS。用1 mL PI染液染色，4℃避光30 min。上機檢測，進行結(jié)果分析。

4 Annexin V-PI雙染測定細胞凋亡

分別收集對照組、VPA組、STI571組和VPA聯(lián)合STI571組的細胞，PBS洗2次，離心棄上清，懸于結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細胞濃度為1×109cells/L。加10 μL FITC 標記的 Annexin V 和 10 μL PI，混勻，避光室溫孵育10 min。用結(jié)合緩沖液洗1次后用CoulterElite流式細胞儀進行分析。Annexin V(－)PI(－)為活細胞，AnnexinV(－)PI(+)為機械損傷細胞，AnnexinV(+)PI(－)為早期凋亡細胞，AnnexinV(+)PI(+)為晚期凋亡細胞。

5R T-PCR檢測mRNA水平

按照Trizol試劑說明書進行。收集各組細胞，PBS洗滌，離心棄上清后加入1 mL Trizol，15～30℃放置5 min。加入 200 μL氯仿，放置 2～3 min，13 000 r/min，4℃離心15 min。將上層水相層轉(zhuǎn)到一新的離心管，加入異丙醇500 μL，放置10 min，13 000 r/min，4℃離心 10 min，棄上清。用 1 mL 75%乙醇洗滌1遍，空氣中晾干。加入50 μL滅菌無RNA酶的超純水溶解。取5 μL RNA溶液稀釋100倍測 A260和 A280值，計算 A260/A280比值及最終RNA的含量。最后取5 μL RNA溶液用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。取2 μg RNA加入1 μL引物并以DEPC水配成終體積為25 μL的反應體系。將上述反應體系在70℃預變性5 min，立即放于冰上，加入下列物質(zhì):5 μL 5 × RT Buffer、1 μL 25 mmol dNTPs、25U RNasin、200 μmol/L M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，37 ℃1 h，95℃ 5 min反應后取得cDNA。

然后熒光定量PCR檢測相關(guān)基因mRNA水平，反應體系為 10 μL 5 × PCR Buffer、15 pmol上下游引物、1 μL 10 mmol dNTPs、7.0 pmol探針、3U Taq DNA聚合酶和5 μL待測樣本或陽性定量模板(cDNA)，最后加無菌去離子水配成終體積為50 μL反應體系。相關(guān)基因的引物見表1。

表1 引物和探針序列Table 1.The primer and probe sequences

6 Western blotting檢測蛋白水平

取對數(shù)生長期不同組別的K562細胞，PBS洗2遍，加蛋白抽提液抽提總蛋白，測定蛋白濃度，取蛋白50 μg，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，常規(guī)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，用含5%脫脂牛奶的 TBST(Tris-buffered saline and Tween 20)封閉液封閉過夜，用Ⅰ抗4℃孵育過夜，1∶2 000稀釋的辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗室溫孵育1 h，用 TBST洗3次，增強型化學發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescent，ECL)顯色液顯色目的條帶，用ImageJ分析軟件進行灰度值分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。

7 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)描述。使用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0分析，兩組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD檢驗進行組間兩兩比較，方差不齊時采用Tamhane檢驗進行組間兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 VPA與STI571聯(lián)合用藥對K562細胞周期和細胞凋亡的影響

我們前期研究［3］獲得了VPA處理K562細胞的濃度-細胞生長抑制率曲線以及時間-細胞生長抑制率曲線，根據(jù)結(jié)果，我們?nèi)?VPA的實驗濃度為2 mmol/L。此濃度的 VPA 和0.5 μmol/L STI571聯(lián)合處理K562細胞，與未處理組(對照組)相比，48 h后細胞周期發(fā)生阻滯，主要表現(xiàn)為G0/G1期細胞增多(79.73% ± 2.30%vs 40.13% ±2.12%)，S 期細胞減少(18.19% ±1.32%vs 50.42% ±2.65%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。兩藥聯(lián)合與單藥作用相比，其阻滯作用無明顯差異，而細胞凋亡則有明顯增加(P ＜0.05)，見圖1、2 和表2。

2 VPA與STI571聯(lián)合用藥對K562細胞Bcr/Abl mRNA表達水平的影響

2 mmol/L VPA 和0.5 μmol/L STI571 聯(lián)合處理K562細胞24 h后，VPA組以及聯(lián)合用藥組檢測不到Bcr/Abl mRNA，而單用STI571組仍然可以檢測到一定數(shù)量水平的 mRNA ［(64.17±12.27)×109copies/(g total mRNA)］，而且與對照組的差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見表2。

3 VPA與STI571聯(lián)合用藥對K562細胞總PKB和p-PKB蛋白水平的影響

2 mmol/L VPA 和0.5 μmol/L STI571 聯(lián)合處理K562細胞，加藥后5、10、30 min以及24 h分別檢測了細胞總PKB和p-PKB蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在處理5 min后，單藥組以及聯(lián)合用藥組的p-PKB蛋白水平均下降，直到24 h后幾乎檢測不到，而總PKB蛋白水平無明顯變化，見圖3、表3。

Figure 1.Effects of VPA and STI571 on the cell cycle of K562 cells.圖1 VPA與STI571對K562細胞細胞周期的影響

Figure 2.Effects of VPA and STI571 on K562 cell apoptosis.圖2 VPA與STI571對K562細胞凋亡的影響

表2 VPA與STI571聯(lián)用對K562細胞細胞周期、凋亡及Bcr/Abl mRNA表達的影響Table 2.Effects of VPA and STI571 on cell cycle，apoptosis and Bcr/Abl mRNA expression in K562 cells(Mean±SD.n=3)

討 論

Figure 3.Impacts of VPA and STI571 on PKB and p-PKB expression in K562 cells.圖3 VPA聯(lián)合STI571對K562細胞PKB以及p-PKB表達的影響

表觀遺傳學在腫瘤發(fā)生中的作用是近年來的研究熱點。科學家發(fā)現(xiàn)DNA啟動子區(qū)過甲基化和染色質(zhì)中的組蛋白去乙?；揎検侵饕谋碛^遺傳學改變形式。因此，去甲基化藥物以及HDACI也成為治療惡性腫瘤的新型藥物。去甲基化藥物的代表——地西他濱，在臨床治療骨髓增生異常綜合征以及難治性白血病中獲得較肯定的療效，這充分展示了靶向表觀遺傳學異常藥物的應用前景。VPA是一種傳統(tǒng)的抗癲癇藥物，自1985年VPA被首次報道可抑制腫瘤細胞增殖后，大量的基礎(chǔ)和臨床工作者開始致力于這種新型的HADCI在抗腫瘤方面的研究［4］。我們的既往研究發(fā)現(xiàn)VPA能導致慢性粒細胞白血病細胞K562細胞周期阻滯并引起細胞凋亡［3，5-7］。本實驗是在前期工作的基礎(chǔ)上進一步研究VPA聯(lián)合STI571對K562細胞增殖的影響及其可能機制。

表3 VPA聯(lián)合STI571對K562細胞總PKB和p-PKB表達的影響Table 3.Effects of VPA and STI571 on the expression of PKB and p-PKB in K562 cells(Mean±SD.n=3)

我們的實驗結(jié)果顯示，VPA聯(lián)合STI571對促進K562細胞的凋亡具有協(xié)同作用，這與Buchi等［8］以及Morotti等［9］研究組的報道一致，他們還發(fā)現(xiàn)這種協(xié)同作用在其它CML的細胞株以及CML患者的原代細胞中同樣存在。我們同時檢測了VPA聯(lián)合STI571對K562細胞周期的影響，與對照組相比，兩藥合用能使細胞周期發(fā)生阻滯，主要表現(xiàn)為G0/G1期細胞增多，S期細胞減少。然而兩藥聯(lián)合與單藥作用相比，其阻滯作用無明顯增加，說明 VPA聯(lián)合STI571對細胞周期的影響無協(xié)同作用，這表明VPA增強STI571促K562細胞凋亡的作用并不是通過增加細胞周期阻滯介導的。

我們進一步檢測了兩藥聯(lián)用對Bcr/Abl融合基因的影響。實驗結(jié)果表明，VPA和STI571聯(lián)合處理K562細胞24 h后，VPA組以及聯(lián)合用藥組檢測不到Bcr/Abl mRNA，而單用STI571組仍然可以檢測到，而且比未加藥組高，這其中的原因并不清楚，推測可能是一種藥物選擇下的代償反應，這種代償反應也有可能是臨床上部分病人產(chǎn)生耐藥的原因［10］。Buchi等［8］的結(jié)果和我們的有所不同，他們的結(jié)果顯示，STI571單藥處理LAMA84S細胞48h后，Bcr/Abl mRNA拷貝數(shù)輕微下降。這可能與我們處理時間為24 h，他們的實驗時間為48 h以及所用的細胞株不同有關(guān)。然而，他們發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)用后Bcr/Abl mRNA幾乎降低到零水平，這與我們的結(jié)果相似。

STI571抗CML作用的機制主要是競爭性結(jié)合Abl酪氨酸激酶催化部位的ATP結(jié)合位點，使該激酶不能與ATP結(jié)合，導致Bcr/Abl融合蛋白失去催化活性，進而阻斷了異常信號轉(zhuǎn)導過程［11］?，F(xiàn)已明確，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路活化是Bcr/Abl融合蛋白的下游信號事件之一［12］。PI3K被包括細胞因子受體或Bcr/Abl融合蛋白等酪氨酸激酶激活后，促使第二信使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3)形成，后者募集PKB到胞膜內(nèi)側(cè)并被其它激酶催化發(fā)生磷酸化而激活。p-PKB通過激活與細胞生長和增殖等有關(guān)的多條細胞信號通路，促進細胞的生長增殖。所以，STI571也有可能通過抑制Bcr/Abl融合蛋白的催化活性，阻斷PI3K信號通路活化，從而抑制CML細胞的增殖。我們的實驗結(jié)果證實了這一點，STI571處理K562細胞后，p-PKB水平明顯低于對照組，而總PKB水平基本無變化。

VPA作為一種具有抗腫瘤活性的藥物，其主要作用機制是抑制HDAC活性，除此之外，它還可以干擾細胞第二信使PIP3的產(chǎn)生和下游信號的激活［13］。基于上述理論基礎(chǔ)，我們的實驗進一步檢測了VPA處理后K562細胞內(nèi)p-PKB的蛋白水平。結(jié)果顯示VPA可以在孵育5 min后快速下調(diào)p-PKB的蛋白水平，到孵育24 h后基本檢測不到。這一結(jié)果表明VPA可能通過抑制K562細胞中PI3K信號通路的活化，減少p-PKB水平，從而干擾細胞增殖信號的轉(zhuǎn)導。盡管本實驗未進一步證實VPA的這種作用是直接抑制了PI3K信號，還是通過阻斷Bcr/Abl信號通路而間接發(fā)揮作用的，但是我們的結(jié)果表明VPA聯(lián)合STI571處理K562細胞后，其p-PKB水平較單藥組更低，這說明兩藥在抑制PI3K信號轉(zhuǎn)導方面具有協(xié)同作用。

CML疾病進展以及對STI571耐藥與表觀遺傳學的異常有關(guān)，特別是基因甲基化和組蛋白乙酰化，阻止這2個關(guān)鍵過程可能可以克服患者對STI571耐藥［14-15］。因此，VPA作為一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑，從理論上講應該可以逆轉(zhuǎn)細胞對STI571的耐藥。我們實驗的不足之處在于未進一步研究VPA對耐STI571 CML細胞株的作用。然而，國外已經(jīng)有關(guān)于此方面研究的報道。Buchi等［8］的結(jié)果令人鼓舞，他們發(fā)現(xiàn)VPA能協(xié)同STI571促進耐藥CML細胞株LAMA84-R的凋亡，單用STI571增加Bcr/Abl mRNA的轉(zhuǎn)錄，而兩藥聯(lián)用大大降低了Bcr/Abl mRNA水平。這一實驗結(jié)果為VPA應用于耐STI571的CML提供了有力的實驗依據(jù)。Cervera等［16］進一步嘗試了VPA治療CML的臨床試驗。他們用VPA和肼苯噠嗪聯(lián)合STI571治療8例(2例急變期，5例加速期，1例慢性期)，對 STI571耐藥的 CML患者，2例(25%)獲得完全血液學緩解，1例(12.5%)獲得主要細胞遺傳學緩解，1例(12.5%)獲得完全細胞遺傳學緩解，3例(37.5%)疾病穩(wěn)定，僅1例無效。以上基礎(chǔ)和臨床的實驗表明了VPA在治療耐STI571 CML方面的良好應用前景，然而仍需要更多的實驗進一步確定其臨床用藥的適用劑量、藥物搭配以及治療療程等，這也是我們下一步工作的研究方向。

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