黎關龍， 黃林靜， 何金波， 馬迎春， 陳海娥， 應 磊， 汪 洋， 王萬鐵△

(1溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，浙江溫州325035;2浙江省醫(yī)學科學院衛(wèi)生學研究所毒理學研究室，浙江杭州310013)

以往研究發(fā)現(xiàn)，容量激活性氯離子通道(volumeactivated chloride channel，CLC3)廣泛存在于肺動脈平滑肌細胞上，與肌張力、細胞容量的調(diào)節(jié)和電活動有關［1］。Xiao 等［2］研究證實，阻斷氯離子通道可明顯抑制內(nèi)皮素1誘導的主動脈平滑肌細胞增殖。Hisadome等［3］研究表明，CLC3阻斷劑可顯著抑制各類血管的生成，而且CLC3還與各種生物體的跨膜氯離子轉(zhuǎn)運及相關物質(zhì)分泌密切相關。本室先前研究表明［4］，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路抑制劑能夠減弱低氧高二氧化碳引起的肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的收縮反應。那么此作用與PASMCs上的 CLC3有無關系?尚缺乏實驗證據(jù)。因此，本實驗在低氧高二氧化碳大鼠模型上，觀察CLC3在PASMCs中mRNA和蛋白表達的變化，并探討MAPK信號通路在其中的作用。

材料和方法

1 動物

SPF級標準健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠14只，體重(220±30)g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供［SCXK(浙)2010-0101號］。

2 主要試劑

SB203580(Sigma);U0126(Sigma);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO;上海申工生物技術(shù)有限公司);茴香霉素(anisomycin;Sigma);10%十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfonate，SDS;碧云天生物技術(shù)有限公司);四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED;碧云天生物技術(shù)有限公司);其余試劑為國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 酶消化法取PASMCs 用10%水合氯醛3.3 mL/kg腹腔麻醉SD大鼠，在超凈平臺內(nèi)迅速取出心肺組織，放入盛有4℃ PBS平衡鹽緩沖液的培養(yǎng)皿中，取出左葉肺和右肺中最大的肺葉，分離肺動脈與周圍組織，保留 3～4級動脈(直徑300～700 μm)。去內(nèi)外膜后將平滑肌剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，裝入無菌離心管中，1 000 r/min離心3 min，去上清加入消化酶，于常氧培養(yǎng)箱內(nèi)靜置消化15 min后加入培養(yǎng)基5 mL，吹打。吸出細胞懸液收集于離心管中。原消化酶加回組織塊中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)消化5 min，按上述步驟收集細胞。再重復消化操作1～2次。以2×108/L的密度種植于培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2 PASMCs的傳代培養(yǎng) 當細胞生長達培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)皿)80% ～90%左右時，吸去培養(yǎng)液，用2～3 mL磷酸鹽緩沖溶液(phosphate-buffered solution，PBS)清洗培養(yǎng)瓶2次，然后用0.25%胰蛋白酶消化細胞，時間大約為0.5～2 min，反復吹打使貼壁細胞脫落，離心、吹打，制成單細胞懸液。取10～30 μL計數(shù)，將適宜密度的單細胞懸液分置于3～4個培養(yǎng)瓶，加適量含15%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞傳代至第2代時可凍存。

3.3 PASMCs的凍存和復蘇 (1)凍存:由于實驗研究中經(jīng)常使用第4～5代細胞，而大鼠細胞多次傳代會引起異化，生物學性狀發(fā)生改變，所以需將細胞早期細胞進行凍存。凍存步驟:細胞在第2代時，選擇對數(shù)生長期細胞，在凍存前1 d換培養(yǎng)液。用胰蛋白酶根據(jù)傳代方法消化單層生長細胞，1 000 r/min離心5 min，加入配制好的凍存培養(yǎng)液(含20%FBS、10%DMSO的DMEM培養(yǎng)液)，凍存液中細胞的最終密度為(5～10)×109cells/L，然后依次4℃、20℃、-70℃液氮保存。凍存須確保密封。(2)復蘇:復蘇細胞應快速融化，與凍存的要求相反。將凍存管投入37℃溫水中，輕輕搖動使其盡快融化后用75%乙醇消毒，將液體移入無菌離心管，加入10倍培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 mL液體吹打，接種細胞密度宜為5×108cells/L，次日觀察并換液培養(yǎng)。

3.4 PASMCs存活率的測定 取消化傳代的細胞懸液9滴，加入0.4%臺盼藍液1滴，混勻后3 min內(nèi)吸取1滴于計數(shù)板上，靜置3 min，在顯微鏡下觀察。若細胞核染色，則為不正常細胞或死亡細胞;若未著色，則為存活細胞。

3.5 差異貼壁法純化細胞 細胞傳至3代后，按傳代方法消化、吹打細胞，然后使細胞在第1瓶中貼壁15 min，光鏡下可見部分細胞貼壁。后將第1瓶中培養(yǎng)基移入第2瓶中，使細胞再次貼壁15 min，光鏡下又可見大部分細胞貼壁。最后再將第2瓶中培養(yǎng)基移入第3瓶中，再使細胞貼壁，后將3瓶均補齊培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d后，光鏡下觀察:第1瓶中以較大長梭形細胞為主，為成纖維細胞;第2瓶為混和細胞;第3瓶中為較純的梭形平滑肌細胞。取第2瓶細胞繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復純化幾次獲得較純的平滑肌細胞［5］。

3.6 PASMCs的鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并攝片，激光共聚焦免疫熒光染色法分別檢測DAPI(激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光峰值630 nm)標記的細胞核及FITC(激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光峰值525 nm)標記的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體。

3.7 實驗分組 取第4～5代生長良好的對數(shù)生長期PASMCs制成細胞懸液，按2×108cells/L的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入含15%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待融合成單層細胞時(約80%鋪滿)換成無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，同步后進行藥物干預(30 min內(nèi)完成加藥操作)。(1)對照組(C):DMEM、5%CO2、21%O2、37℃、48 h;(2)低氧高二氧化碳組(H):DMEM、6%CO2、1%O2、37 ℃、48 h;(3)DMSO+ 低氧高二氧化碳對照組(D):0.05%DMSO、6%CO2、1%O2、37℃、48 h;(4)U0126+低氧高二氧化碳干預組(U):10 μmol/L U0126、6%CO2、1%O2、37 ℃、48 h;(5)SB203580+低氧高二氧化碳干預組(SB):10 μmol/L SB203580、6%CO2、1%O2、37 ℃、48 h;(6)anisomycin+低氧高二氧化碳干預組(A):10 μmol/L anisomycin、6%CO2、1%O2、37 ℃、48 h。以上每組6 皿細胞。

3.8 蛋白免疫印跡法檢測PASMCs CLC3蛋白的表達 詳細步驟參考李丹等［6］的實驗方法。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析CLC3灰度值，以目的蛋白CLC3條帶灰度值和 β-actin灰度值比值代表CLC3表達的含量。

3.9 RT-PCR法檢測PASMCs中CLC3 mRNA的表達 詳細步驟參考李丹等［6］的實驗方法。cDNA采用相應特異性引物進行PCR擴增，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，序列如下:CLC3上游引物 5’-GTAAATGGGTTGGTGATGCC-3’，下游引物 5’-CTGAGGGCAAATCCCACTAA-3’，產(chǎn)物 277 bp;β-actin 上 游 引 物 5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’，下游引物 5’-TCGGGGGATCGGAACCGCTCA-3’，產(chǎn)物 400 bp。采用 Gel-Pro Analyzer軟件分析測定吸光度(A)，以CLC3擴增帶與β-actin擴增帶的A值之比(relative A value)作為CLC3 mRNA的相對表達量。實驗重復6次。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件分析。計量資料均進行正態(tài)性檢驗，以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多方差齊者組樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗，方差齊者組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnett檢驗;雙變量相關性分析采用Bivariate過程的Pearson相關分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 原代培養(yǎng)大鼠PASMCs的培養(yǎng)和鑒定

1.1 細胞形態(tài)學生長特點 平滑肌細胞原代培養(yǎng)72 h，此時細胞已經(jīng)貼壁呈長梭形，換液后生長繁殖加快，間隙變小，成束的平滑肌細胞平行排列，部分細胞可多層重疊。培養(yǎng)到第5天后，細胞密度低時常交織呈網(wǎng)狀，密度高時則呈旋渦狀或者柵欄狀，呈典型的“峰-谷”狀生長。鏡下顯示細胞呈梭形，具有長短不等的數(shù)個突起，彼此融合，邊界不清，折光性好，細胞核位于細胞中央，呈卵圓形，多為3～5個。傳代培養(yǎng)的細胞生長規(guī)律與原代培養(yǎng)相似，傳代后第2天生長繁殖活躍，4～6 d后生長進入平臺期，可以進行下次傳代，連續(xù)培養(yǎng)多代仍可保持較好狀態(tài)，見圖1A。

1.2 免疫細胞熒光法鑒定PASMCs 培養(yǎng)第4～5代的細胞經(jīng)小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體孵育，F(xiàn)ITC和DAPI雙染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察，約99%呈陽性反應。高倍鏡下可見胞漿內(nèi)FITC標記的α-SMA發(fā)綠色熒光，與細胞長軸平行呈纖維細絲狀，此為α-SMA，僅平滑肌細胞呈陽性反應;DAPI標記的細胞核呈紅色熒光，卵圓形居中，見圖1B。

Figure 1.Primarily cultured rat PASMCs(A;×100)and their immunofluorescence identification(B;×400).Green:FITC-labelled α-SMA immunofluorescence;red:DAPI fluorescence.圖1 大鼠肺動脈平滑肌細胞的原代培養(yǎng)和免疫熒光鑒定

1.3 臺盼藍染色結(jié)果 鏡下共計數(shù)2 600個細胞，其中71個陽性細胞，陰性率為97.3%，說明用消化法傳代的細胞存活率高。經(jīng)凍存復蘇后陰性率達87.2%，說明凍存復蘇后的細胞存活率仍較高。

2 各組PASMCs CLC3 mRNA表達的變化

2.1 低氧高二氧化碳對PASMCs中CLC3 mRNA表達的影響 與C組相比，H組CLC3 mRNA表達量均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖2和表1。

2.2 低氧高二氧化碳條件下U0126和SB203580對PASMCs CLC3 mRNA表達的影響 與C組比較，H組、D+H組、U+H組、SB+H組及A+H組CLC3 mRNA表達均明顯上調(diào)(均P＜0.01);與H組比較，D+H組CLC3 mRNA表達略微上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，U+H組和A+H組CLC3 mRNA表達顯著下調(diào)(均P＜0.01)，SB+H組CLC3 mRNA表達均明顯上調(diào)(P＜0.01);與D+H組比較，U+H組和A+H組CLC3 mRNA表達顯著下調(diào)(均P＜0.01)，SB+H組CLC3 mRNA表達均明顯上調(diào)(P＜0.01)，見圖2和表1。

Figure 2.The expression of CLC3 mRNA in all groups.C:control group;H:hypoxic and hypercapnic group;D+H:DMSO+hypoxic and hypercapnic group;U+H:U0126+hypoxic and hypercapnic group;SB+H:SB203580+hypoxic and hypercapnic group;A+H:anisomycin+hypoxic and hypercapnic group.圖2 各組細胞CLC3 mRNA的表達

表16 組PASMCs中CLC3 mRNA表達變化的比較Table 1. Changes of CLC3 mRNA expression in all groups(Mean±SD.n=6)

Figure 3.The expression of CLC3 protein in all groups.圖3 各組細胞CLC3蛋白的表達

3 各組PASMCs中CLC3蛋白表達的變化

3.1 低氧高二氧化碳對PASMCs CLC3蛋白表達的影響 與C組相比，H組CLC3蛋白的表達顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖3和表2。

3.2 低氧高二氧化碳條件下U0126和SB203580對PASMCs CLC3蛋白表達的影響 與C組比較，H組、D+H組、SB+H組CLC3蛋白表達均明顯上調(diào)(均P＜0.01)，U+H組及A+H組CLC3蛋白表達輕微上調(diào)(均P＜0.05);與H組比較，D+H組CLC3蛋白表達略微下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，U+H組CLC3蛋白表達均明顯下調(diào)(P＜0.01)，SB+H組CLC3蛋白表達均明顯上調(diào)(P＜0.01)，A+H組CLC3蛋白表達輕微下調(diào)(P＜0.05);與D+H組比較，U+H組CLC3蛋白表達均明顯下調(diào)(P＜0.01)，SB+H組CLC3蛋白表達均明顯上調(diào)(P＜0.01)，A+H組 CLC3蛋白表達輕微下調(diào)(P＜0.05)，見圖3和表2。

表26 組PASMCs中CLC3蛋白表達變化的比較Table 2. Changes of CLC3 protein expression in all groups(Mean±SD.n=6)

討 論

CLC3 在血管平滑肌細胞上有高表達，4，4′-二異氰基芪-2，2′-二磺酸(4，4′-diisothiocyanatostilbene-2，2′-disulfonic acid，DIDS)可通過阻斷氯離子通道、抑制內(nèi)皮素使細胞膜去極化，從而導致的胞漿鈣離子濃度升高及血管平滑肌細胞增殖，表明其可能在血管平滑肌細胞的生長調(diào)控上發(fā)揮重要的作用［7-8］。Voets［9］的研究也發(fā)現(xiàn)，CLC3與細胞增殖密切相關，表現(xiàn)在肌細胞增殖分裂過程中持續(xù)不斷地調(diào)節(jié)其細胞容量。下調(diào)CLC3，肌細胞則停止增殖和分化;抑制CLC3時可有效抑制內(nèi)皮細胞的增殖。本室先前研究顯示，低氧高二氧化碳能夠通過不同途徑引發(fā)PAMSCs收縮、增殖，導致肺血管重塑［10］。本實驗又發(fā)現(xiàn)，低氧高二氧化碳條件下PAMSCs中CLC3 mRNA和蛋白表達量較常氧條件下明顯升高，表明低氧高二氧化碳可上調(diào)大鼠PASMCs上CLC3 mRNA和蛋白的表達，其機制可能是低氧高二氧化碳引起PASMCs膜通透性增加和［Ca2+］升高，細胞內(nèi)［Ca2+］升高激活CLC3，氯離子大量外流，引起細胞膜去極化，繼而開放電壓依賴性鈣通道，使細胞外Ca2+大量內(nèi)流，細胞內(nèi)［Ca2+］進一步升高，Ca2+與胞漿內(nèi)的鈣調(diào)素結(jié)合使肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化，進而引發(fā)平滑肌細胞收縮、增殖。

Zhang等［11］認為，ERK1/2 通路和 p38 MAPK 通路之間可能存在某種相互制約關系，抑制p38 MAPK通路的同時可加強ERK1/2通路的激活，導致凋亡的延遲。而p38 MAPK促進凋亡或抑制凋亡與p38 MAPK激活的性質(zhì)有關，如短期p38 MAPK的激活可引起造血腫瘤細胞KT6分化，長期p38 MAPK的激活則可促進其凋亡;在TNF-α處理的中性粒細胞中，早期 p38 MAPK的激活可延遲凋亡，而晚期 p38 MAPK的激活可加速凋亡［12］。因此，可以認為中、晚期p38 MAPK的高活化狀態(tài)是一種保護機制，以此來對抗低氧高二氧化碳引起的肺血管壁增殖重塑。本實驗顯示:使用 SB203580后，PASMCs中 CLC3 mRNA和蛋白表達水平明顯上調(diào)，顯著高于低氧高二氧化碳組;應用U0126后，PASMCs CLC3 mRNA和蛋白表達水平卻明顯低于低氧高二氧化碳組。這提示p38 MAPK通路抑制劑SB203580可上調(diào)大鼠PASMCs CLC3 mRNA和蛋白的表達;ERK1/2通路抑制劑U0126能下調(diào)大鼠PASMCs CLC3 mRNA和蛋白的表達。

Anisomycin作為p38 MAPK通路的激活劑能夠明顯抑制單向或雙向混合淋巴細胞反應中T細胞的增殖活性，抑制T細胞表面早期及中期活化標志分子CD69和 CD25的表達［13］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，CLC3 mRNA和蛋白含量在anisomycin干預下，較低氧高二氧化碳組明顯降低，表明 anisomycin可下調(diào)大鼠PASMCs CLC3 mRNA和蛋白的表達。

綜上所述，低氧高二氧化碳可上調(diào)大鼠PASMCs中CLC3的表達，可能引發(fā)平滑肌細胞增殖;p38 MAPK可能參與了抑制CLC3引起的大鼠PASMCs增殖;ERK1/2可能參與了 CLC3引起的大鼠PASMCs增殖。

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