張 昊， 王偉偉， 薛 過， 張偉華， 王麗娜，林 巖， 姜曉姝， 田 野， 徐長慶， 趙雅君△

(哈爾濱醫(yī)科大學 1病理生理教研室，4機能中心，黑龍江哈爾濱150086;2黑龍江省電力醫(yī)院病理科，黑龍江哈爾濱150090;3齊齊哈爾醫(yī)學院病理生理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006)

隨著社會人口老齡化速度的加快，人們對衰老及衰老相關(guān)性疾病日益重視。研究顯示，心肌衰老伴隨著心肌收縮力下降，心輸出量減少，最終導致心功能障礙，心血管疾病發(fā)生［1］。

自噬是真核細胞將胞質(zhì)內(nèi)損傷、衰老的蛋白質(zhì)降解，滿足自身代謝和細胞器更新需要，維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制［2］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可引起衰老有關(guān)的病理反應［3］;而增強自噬可延緩衰老及延長壽命［4-5］。因此，尋找合適的能夠誘導自噬的干預措施，對延緩衰老及預防衰老相關(guān)疾病的發(fā)生有重要意義。

細胞凋亡是在基因調(diào)控下引起的細胞主動死亡過程［6］。心肌細胞凋亡對維持心臟正常形態(tài)結(jié)構(gòu)具有重要作用、并與心臟的病理過程密切相關(guān)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，隨年齡增加心肌細胞氧化損傷增強、線粒體功能障礙、鈣穩(wěn)態(tài)失衡增強、能量產(chǎn)生減少，這些因素均能導致細胞壞死和細胞凋亡增加。線粒體是影響細胞凋亡進程的核心要素，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)是線粒體內(nèi)外信息交流的樞紐，其開放是調(diào)控線粒體途徑細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)［8］。文獻報道，中低強度的有氧運動可改善線粒體的功能，使心臟在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、代謝、功能方面產(chǎn)生一系列良好適應，使心臟功能增強［9］。

本實驗通過觀察運動訓練對衰老大鼠心臟功能、心肌細胞自噬［包括自噬相關(guān)蛋白5(autophagyrelated protein 5，Atg5)、Beclin 1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associate protein 1 light chain 3，LC3)表達］、mPTP開放及細胞凋亡的影響，探討運動訓練在改善老齡心臟功能中的作用及機制，為通過運動訓練的方法預防或減輕年齡相關(guān)的心血管疾病提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

Atg5、Beclin 1、LC3、細胞色素 C(cytochrome C，Cyt C)、GAPDH和Cyt C氧化酶Ⅳ (Cyt C oxidaseⅣ，COX-Ⅳ)Ⅰ抗(Proteintech)，羊抗鼠IgG-AP和羊抗兔IgG-APⅡ抗(北京中杉金橋公司)，TUNEL試劑盒(Roche)，心肌線粒體分離試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 主要儀器

FT-200動物跑步機(成都泰盟科技有限公司)，US-640型紫外分光光度計(Beckman)，Model 550酶標儀(Bio-Rad)，H-600透射電鏡(Hitachi)，低溫離心機(Beckman)，恒溫水浴鍋(成都泰盟科技有限公司)。

3 主要方法

3.1 實驗分組 雄性 Wistar大鼠，清潔級，由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院動物中心提供。實驗分3組。青年組(young)，體重(230±20)g，自由飲水進食的3月齡大鼠。老年組(old)，18月齡自由飲水進食的大鼠，體重(500±20)g。老年運動組(old+exercise，old+Ex):18月齡大鼠，梯度跑臺運動6周，跑臺速度為20 m/min，以20 min/d開始運動，每3 d運動時間增加5 min，直至60 min/d時，運動時間不再變化。

3.2 超聲心動圖測定大鼠心臟功能 大鼠麻醉后仰臥位固定，胸部備皮，小動物超聲探頭(14.0 MHz)置于大鼠左前胸，連接超聲檢查儀，進行超聲檢查［10］。測量左心室收縮末期直徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、左心室舒張末期直徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室縮短分數(shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

3.3 透射電鏡觀察大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及自噬體取大鼠左心室心尖部組織體積約(1～2)mm×1 mm×1 mm大小，4℃戊二醛磷酸緩沖液固定液24 h。常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射電鏡下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化及自噬體的形成。

3.4 Western blotting檢測心肌組織Atg5、Beclin 1 和LC3蛋白的表達 取大鼠左心室前壁組織加入蛋白裂解液，低溫研磨后置于冰上作用30 min，4℃、12 000×g離心15 min，取上清，以牛血清白蛋白為標準，用Bradford法對提蛋白進行定量。取80 μg蛋白，進行10%SDS-PAGE電泳，然后100 V 1 h轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。該膜在含80 g/L脫脂奶粉的封閉液中封閉37℃作用1 h后，加入Atg5、Beclin 1和LC3Ⅰ/Ⅱ抗體 (1∶500)4℃孵育過夜。第2天取出膜進行反復洗膜，之后將膜與堿性磷酸酶標記的IgG抗體(1∶1 000)室溫輕搖1 h，洗膜、顯色，同時以用GAPDH抗體(1∶500)作為內(nèi)參照。

3.5 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 取大鼠左心室前壁組織進行石蠟切片，按試劑盒說明書操作，采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡。光鏡下凋亡的細胞核染成棕褐色，每張切片隨機取5個以上的高倍視野，數(shù)不少于200個心肌細胞核，計算細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI;%)=陽性細胞核數(shù)/(陽性細胞核數(shù)+陰性細胞核數(shù))×100%。

3.6 分離大鼠心肌線粒體 線粒體的分離采用常規(guī)差速離心法。取大鼠左心室肌組織200 mg冰浴上剪碎，加入線粒體分離介質(zhì)冰上研磨制成組織勻漿(心肌組織∶介質(zhì) =1∶5)，低溫(－4℃)、800×g離心5 min，將勻漿后的上清再次12 000×g離心10 min，棄上清，獲取的沉淀即為提取的心肌線粒體，用線粒體貯存緩沖液重新懸起線粒體備用。

3.7 Western blotting檢測心肌線粒體Cyt C蛋白表達 分離的大鼠心肌線粒體，加入蛋白裂解液進行裂解，Westernblotting檢測線粒體CytC蛋白的表達(抗體稀釋倍數(shù)1∶500)，具體操作方法同上。

3.8 分光光度計法測定鈣誘導的mPTP開放 應用上述方法提取到的大鼠心肌線粒體用Bradford方法測定線粒體蛋白含量。反應開始時在線粒體反應緩沖液(250 mmol·L－1sucrose，5 mmol·L－1KH2PO4，3 mmol·L－1琥珀酸鈉，pH 7.2)內(nèi)加入線粒體，使線粒體蛋白終濃度為0.5 g·L－1，混勻后記錄其在540 nm處的初始吸光度(A540)，1 min后加入200 μmol·L－1的 CaCl2，連續(xù)記錄 20 min 內(nèi)吸光度的變化，每間隔1 min記錄1次。CaCl2可使線粒體腫脹，導致mPTP開放，使線粒體吸光度值下降，因此，線粒體的吸光度值越小，說明mPTP的開放程度越大。

3.9 透射電鏡觀察心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化 取差速離心法獲得的大鼠心肌線粒體約1～2 mm3，4℃戊二醛磷酸鹽緩沖液固定24 h。常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射電鏡下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化及自噬體的形成。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，每組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。多組間比較用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 大鼠心臟功能變化

超聲心動圖測量大鼠心臟功能結(jié)果顯示，與young組比較，old組左心功能明顯降低，表現(xiàn)為LVEDD及LVESD顯著增大，LVEF及LVFS均顯著降低(均 P＜0.05);與 old組比較，old+Ex組的LVEDD及 LVESD較 old組有明顯降低，LVEF和LVFS顯著提高(均 P ＜0.05)，見表1。

表1 各實驗組大鼠心臟功能變化情況Table 1.Changes of heart functions of rats in different groups(Mean±SD.n=8)

2 心肌超微結(jié)構(gòu)變化

電子顯微鏡可見，young組心肌肌原纖維排列整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，線粒體(白色箭頭所示)基質(zhì)致密，嵴排列整齊，并可見雙層膜的自噬體(黑色箭頭所示)。Old組大鼠心肌肌原纖維排列紊亂，明暗帶模糊，線粒體基質(zhì)密度降低、數(shù)量減少，偶見自噬體，肌原纖維間可見大量脂褐素顆粒沉積。Old+Ex組大鼠心肌線粒體基質(zhì)致密、數(shù)目增多、膜完整，肌絲間脂褐素顆粒沉積減少，自噬體形成明顯增多，見圖1。

Figure 1.Transmission electron microscopy for myocardial ultrastructure(black arrows indicate autophagosome and white arrows indicate mitochondria)in rats(×10 000).A:young group;B:old group;C:old+Ex group.圖1 透射電鏡下觀察大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的變化

3 心肌Beclin 1、Atg5和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達

與young組比較，old組大鼠心肌Atg5與Beclin 1蛋白表達水平降低(P＜0.01)，LC3Ⅰ向 LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換明顯減少，使 LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降(P＜0.01);與old組比較，old+Ex組心肌Atg5與Beclin 1蛋白表達增加(P ＜0.01)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加(P ＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Western blotting analysis of the changes of Atg5，Beclin 1 and LC3 Ⅱ/Ⅰprotein expression in cardiac tissues of rats.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs young group;##P ＜0.01 vs old group.圖2 免疫印跡法分析大鼠心肌組織Atg5、Beclin 1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白質(zhì)表達變化

4 心肌細胞凋亡分析

TUNEL方法檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，old組心肌細胞凋亡率為(13.3±2.1)%，明顯高于青年組的(1.9 ±0.5)%，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。Old+Ex組的細胞凋亡率為(7.6±1.1)%，明顯低于 old 組(P ＜0.01)，見圖3。

5 大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

透射電鏡下可見分離的young組心肌線粒體內(nèi)、外膜完整，線粒體嵴排列整齊，基質(zhì)致密;在old組，可見線粒體基質(zhì)密度明顯下降，嵴排列紊亂，多數(shù)線粒體膜破裂，完整線粒體數(shù)目明顯降低;在old+Ex組，可見線粒體基質(zhì)較致密，膜完整線粒體數(shù)目增多，見圖4。

6 心肌線粒體Cyt C蛋白表達

Western blotting結(jié)果顯示，與young組比較，old組心肌線粒體Cyt C表達水平明顯降低(P＜0.01);與old組比較，old+Ex組Cyt C蛋白表達水平明顯增加，有顯著差異(P ＜0.01)，見圖5。

Figure 3.Detection of cardiomyocyte apoptosis with TUNEL assay(×400).The arrows indicate the apoptotic cells.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs young group;##P ＜0.01 vs old group.圖3 TUNEL方法檢測大鼠心肌細胞凋亡

Figure 4.Transmission electron microscopy to observe the ultrastructure of mitochondria isolated from rat hearts(×20 000).A:young group;B:old group;C:old+Ex group.圖4 透射電鏡觀察分離的大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

7 mPTP開放狀態(tài)

與young組比較，old組線粒體的A540值出現(xiàn)明顯的下降 (P＜0.01)。而old+Ex組的A540值明顯高于old組，組間比較差異顯著(P＜0.05)，見圖6。

討 論

Figure 5.Western blotting analysis of the changes of Cyt C protein expression in mitochondria isolated from cardiac tissues of rats.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs young group;##P ＜0.01 vs old group.圖5 免疫印跡方法檢測大鼠心肌線粒體Cyt C蛋白質(zhì)表達變化

Figure 6.Assay of calcium-induced opening of mitochondrial permeability transition pore(mPTP)in mitochondria isolated from cardiac tissues of rats.Mean±SD.n=6.*P ＜ 0.05 vs young group;#P ＜ 0.05 vs old group.圖6 鈣誘導的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放測定

細胞自噬是由一系列自噬相關(guān)蛋白介導的，這些蛋白質(zhì)在自噬體形成的不同階段發(fā)揮作用，如Beclin 1(酵母Atg6的同系物)和Atg5是哺乳類動物參與自噬的特異性基因，通過檢測其蛋白表達，可以證明自噬的發(fā)生。LC3是自噬的標志蛋白，自噬形成時，胞漿LC3(LC3Ⅰ型)會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ(位于自噬體的膜上)，因此，利用LC3Ⅱ/Ⅰ的比值可以評價自噬水平的高低［11］。此外，應用透射電鏡動態(tài)觀察自噬體的形成是檢測自噬發(fā)生的金標準［11］。本研究中，我們首先利用透射電鏡觀察大鼠心肌自噬體的形成，發(fā)現(xiàn)老齡大鼠心肌自噬體形成明顯減少、同時我們也觀察到老齡大鼠心肌Beclin 1和Atg5蛋白表達下調(diào)、心肌細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低，研究顯示老齡大鼠心肌細胞自噬水平明顯下降。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，持續(xù)6周的有氧運動訓練，大鼠心肌Beclin 1和Atg5表達增加，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換增加，透射電鏡下觀察到具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體形成明顯增多;同時我們注意到，運動訓練的老齡大鼠LVEF與LVFS明顯升高(與old組比較，P＜0.05)，LVESD與LVEDD均縮小(與old組比較，P＜0.05)。這說明運動訓練在上調(diào)老齡大鼠心肌自噬水平同時，也提高了老齡大鼠的心臟功能。我們分析，運動訓練可能是通過增強老齡心肌自噬活性，加速衰老心肌細胞內(nèi)損傷細胞器的清除及變性蛋白質(zhì)的更新，減輕老齡心肌的細胞損傷，改善老齡大鼠的心臟功能。已有文獻報道，適宜強度的運動訓練可通過上調(diào)細胞自噬水平降解細胞內(nèi)的代謝廢物，維持細胞自身穩(wěn)態(tài)［12］。Chen 等［13］在心臟的研究顯示，對心肌梗塞小鼠進行每天30 min、速度1 km·h－1、為期4周的跑臺運動，運動組小鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值是非運動組的2.1倍，證實運動訓練可通過增強自噬活性提高損傷蛋白的降解速率，減輕細胞損傷，增強心臟功能。

線粒體凋亡途徑是介導細胞凋亡的一個重要途徑。mPTP是位于線粒體內(nèi)、外膜間的多蛋白孔道，正常生理情況下，mPTP呈短暫、間歇性的低通透性開放狀態(tài)，參與ADP/ATP的轉(zhuǎn)運，維持線粒體跨膜電位，調(diào)節(jié)線粒體的正常功能。病理情況下，mPTP呈現(xiàn)不可逆的高通透性開放，導致Cyt C及凋亡誘導因子從線粒體膜間腔中釋放入胞漿，引起細胞凋亡或死亡［8］。本研究顯示老年大鼠心肌氧化應激增強(肌絲間有大量脂褐素顆粒沉積)，線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷較青年組明顯、線粒體通透轉(zhuǎn)換孔開放數(shù)目增加，心肌細胞凋亡率增加。而6周有氧運動訓練的老齡大鼠心肌肌絲間脂褐素顆粒沉積明顯減少，自噬體形成增多;與老年組比，線粒體mPTP開放數(shù)目減少，線粒體Cyt C表達上調(diào)，TUNEL染色陽性細胞減少。這提示，適宜的運動訓練可能通過提高老齡大鼠心肌的抗氧化能力、減輕老齡心肌的線粒體的結(jié)構(gòu)損傷，進而抑制mPTP的開放及線粒體Cyt C的釋放，減少了心肌細胞凋亡發(fā)生。相關(guān)研究支持我們的結(jié)論，Kavazis等［14］的研究顯示適宜的運動訓練能增強心臟抗凋亡的能力;耐力訓練能夠減少Cyt C從心肌線粒體的釋放［15］;Marcil等［16］研究表明適宜的運動能降低mPTP開放的敏感性;但也有研究顯示，過于劇烈的運動可損害心肌的結(jié)構(gòu)與功能，引起心肌細胞凋亡。許思毛等［17］研究發(fā)現(xiàn)大負荷跑臺運動可引起大鼠心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)功能破壞，［Ca2+］i升高，ATP 含量下降;金其貫等［18］發(fā)現(xiàn)過度訓練抑制心肌Bcl-2蛋白表達，促進Fas蛋白的表達，誘導心肌細胞凋亡。其機制可能是大強度的力竭運動使機體自由基生成增多，線粒體氧化磷酸化水平降低，誘導線粒體膜通透性改變，最后導致細胞凋亡［19］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬與凋亡可先后發(fā)生或同時共存于同一細胞中。自噬可通過清除破損線粒體延遲和對抗凋亡。自噬對細胞凋亡的抑制作用可能與自噬體包裹損傷的線粒體，進而阻止了Cyt C釋放入細胞質(zhì)，抑制凋亡小體的形成有關(guān)［20-21］?；诖?，我們分析，本研究中運動訓練可能是先激活了老齡大鼠心肌細胞自噬，通過自噬清除細胞內(nèi)損傷的線粒體，進而抑制了線粒體途徑的細胞凋亡，改善了老齡大鼠心臟功能，這也可能是運動訓練減少年齡相關(guān)心血管疾病發(fā)生的機制之一。但是，心肌衰老的病理生理機制比較復雜，運動訓練對衰老心肌的影響與運動的頻率、持續(xù)時間、運動量等諸多因素有關(guān)。因此，運動訓練能否通過激活自噬、抑制凋亡機制降低年齡相關(guān)的心血管疾病的發(fā)生率，仍有待于進一步研究。

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