王臘梅， 鐘 華， 趙 慧， 王 靜， 龐麗娟， 孫志萍， 何 芳△

(1新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院2病理生理教研室，3病理教研室，4醫(yī)學(xué)機(jī)能實驗中心，新疆 石河子832002)

近年來廣泛的研究證實鈣池操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channels，SOC)和受體操縱性鈣通道(receptor-operated Ca2+channels，ROC)是非興奮細(xì)胞介導(dǎo)外Ca2+內(nèi)流的重要通道，參與多種生理和病理生理過程，對維持細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度穩(wěn)定具有重要作用。SOC激活依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)鈣庫耗竭后ER腔內(nèi)Ca2+濃度下降，對Ca2+有高度選擇;ROC激活不依賴鈣庫耗竭，而依賴 G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor，GPCR)-Gq/11-磷脂酶 C(phospholipid lipoidase，PLC)-磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol diphosphate，PIP2)-二脂酰甘油(diacylglycerol，DAG)-蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)通路產(chǎn)生的DAG，對Ca2+缺乏選擇性。研究發(fā)現(xiàn)Ca2+通道蛋白Orai由于其在介導(dǎo)鈣庫操縱的鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry，SOCE)中的作用而受到廣泛關(guān)注。Orai家族最早被認(rèn)為是SOC或稱鈣釋放激活鈣離子通道(Ca2+release-activated Ca2+channel，CRAC)的構(gòu)成蛋白，是4次跨膜蛋白，包括 Orai1、Orai2 和 Orai3［1］。關(guān)于Orai的研究起步較晚，在參與構(gòu)成SOC介導(dǎo)的SOCE上存在爭議。Mercer等［2］在異源表達(dá)基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)、Orai1、Orai2和Orai3的HEK293細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，所有Orai蛋白都能增加SOCE，且增強(qiáng) SOC的作用功效依次是Orai1＞Orai2＞Orai3，其中 Orai3能部分代償 Orai1敲除對細(xì)胞產(chǎn)生的影響。DeHaven等［3］的研究顯示，Orai1、Orai2和Orai3通道都能被胞外Ca2+抑制，且Orai3通道對鈣庫排空過程有一定的抑制作用。

鈣敏感受體(Ca2+-sensing receptor，CaR)為GPCR超家族中C亞族的成員。我們前期的研究發(fā)現(xiàn):在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中，CaR 激活介導(dǎo)了［Ca2+］i升高及一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成過程［4-5］，SOC和ROC以協(xié)同的方式參與了此過程，且瞬時受體電位陽離子通道C亞族成員1(transient receptor potential cation channel，subfamily C，member 1，TRPC1)、STIM1和Orai1為參與上述過程的關(guān)鍵組件之一，那么Orai3是否參與了CaR經(jīng)SOC和ROC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和NO生成呢?本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上以原代培養(yǎng)的HUVECs為研究對象，構(gòu)建Orai3干擾質(zhì)粒，通過分別檢測mRNA和蛋白表達(dá)篩選出抑制效率高的干擾質(zhì)粒，并觀察Orai3基因沉默后對HUVECs中［Ca2+］i和 NO生成的影響，試圖闡明Orai3在CaR介導(dǎo)［Ca2+］i和NO生成中的作用和機(jī)制，為心腦血管疾病防治提供新思路。

材料和方法

1 材料

健康孕婦剖宮產(chǎn)的新鮮臍帶(來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，經(jīng)倫理道德委員會批準(zhǔn)和個人知情同意)。

2 主要試劑

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ScienCell);蛋白酶抑制劑(Calbiochem);兔抗人Orai3多克隆抗體和鼠抗βactin單克隆抗體(Santa Cruz);Ⅱ抗(ProteinTech);ECL發(fā)光試劑盒(Thermo);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與realtime RT-PCR試劑盒(TaKaRa);LipofectamineTM2000與OPTI-MEM(Invitrogen);Fura-2/AM(Invitrogen);DAF-FM DA(NO熒光探針;Beyotime);G418(Biosharp);去內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega);shRNA(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司);引物(友名生物技術(shù)有限公司);其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

3 主要儀器

Ca2+成像系統(tǒng)FV300、倒置熒光顯微鏡IX-70和激光共聚焦顯微鏡FV300(Olympus)。

4 方法

4.1 HUVECs的培養(yǎng)與鑒定 依據(jù)本研究室以前的方法培養(yǎng)HUVECs并傳代［4］，用細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子相關(guān)抗原進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定HUVECs，取生長狀態(tài)良好的第2～5代細(xì)胞用于實驗。

4.2 Orai3基因的shRNA構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 (1)遵循shRNA的設(shè)計原則，根據(jù)GenBank中人Orai3的cDNA序列(NM_152288)，以其同源的編碼DNA序列(coding DNA sequences，CDS)部分設(shè)計、合成 3條shRNA，分別命名為 shOrai3-75、shOrai3-76和 shO-rai3-77，上述序列經(jīng)BLAST軟件分析，與人類基因外顯子無同源性，排除對其它基因的非特異性干擾，并與載體連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒。(2)轉(zhuǎn)染:細(xì)胞生長至70%～90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實驗分為未轉(zhuǎn)染組即空白對照組(control組)、空質(zhì)粒組(vehicle組)和特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組即實驗組(Orai3 shRNA)。以6孔板的1個孔為例，首先取一無菌EP管加250 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基和 5 μL LipofectamineTM2000(Invitrogen)，輕輕混勻。再取另一無菌EP管加250 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基和2 μg質(zhì)粒DNA，輕輕混勻。室溫下孵育5 min后，混勻以上2種復(fù)合物，室溫孵育20 min。最后將此復(fù)合物加入到含有1.5 mL OPTI-MEM的6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)4～6 h后，換無血清ECM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4.3 Real-time RT-PCR檢測HUVECs中Orai3 mRNA的表達(dá) 引物由友名生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。Orai3上游引物5′-GAG AGC TTG TGG GAC CTT CAG TG-3′，下游引物 5′-TAA ACC AAC AAT TGG CTG CCT TC-3′。β-actin 上游引物 5′-ACG GTC AGG TCA TCA CTA TCG-3′，下游引物 5′-GGC ATA GAG GTC TTT ACG GAT G-3′。用 Trizol法抽提細(xì)胞RNA，紫外分光光度儀分別在260 nm和280 nm波長下檢測計算提取的總RNA濃度及純度。然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，以此為模板以β-actin為內(nèi)參照，用real-time RT-PCR試劑盒對mRNA進(jìn)行多聚酶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，其中 SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，樣品cDNA 2.0 μL，滅菌蒸餾水 9.5 μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 30 s;PCR反應(yīng)(95℃ 5 s、60℃ 20 s)，40個循環(huán)。隨之由電腦自動分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，每組實驗重復(fù)4次。

4.4 免疫印跡法檢測HUVECs中Orai3的蛋白表達(dá)及干擾效率 各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48 h后，用G418進(jìn)行穩(wěn)篩，7 d后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，在冰上按1∶100的比例加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液100 μL，用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞，將黏稠狀細(xì)胞裂解產(chǎn)物收集于離心管中。冰中靜置60 min，12 000 r/min、4℃ 離心15 min。取上清到另一離心管，棄去沉淀。取5 μL上清用于 BCA試劑測定蛋白質(zhì)濃度并標(biāo)化，以β-actin為內(nèi)參照。將蛋白樣品加入加樣緩沖液，沸水煮10 min，10 000 r/min離心5 min后上樣。SDS-PAGE電泳分離蛋白，選用硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，用5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h，分別加入抗 Orai3抗體(1∶1 000)，抗 β-actin抗體(1∶800)置于 4 ℃孵育過夜。第2天用TBST洗膜4次，加入Ⅱ抗(1∶5 000)，37℃搖床上孵育1 h。TBST洗3次。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，顯影、定影，獲得實驗結(jié)果，重復(fù)3次。

4.5 HUVECs中Ca2+濃度測定 參照文獻(xiàn)［6］將第2代或第3代HUVECs接種于放有圓形玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞達(dá)80%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后將玻片取出放入自制的灌流槽中，將1 μL濃度為1 mmol/L的 Fura-2/AM 與499 μL含2 mmol/L含鈣液混合后加入灌流槽中，37℃孵育細(xì)胞30 min。沖洗3～5遍后用含鈣液去酯化20 min。將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡上，利用340 nm與380 nm波長的激發(fā)光激發(fā)Ca2+熒光探針Fura-2/AM發(fā)射熒光，用CCD拍攝熒光的動態(tài)變化，通過340 nm和380 nm的熒光強(qiáng)度比值的變化(即Δratio)反映［Ca2+］i，每組實驗重復(fù)3次。

4.6 HUVECs中NO含量的檢測 參照文獻(xiàn)［6］，將第2代或第3代HUVECs接種于放有圓形玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞達(dá)80%左右融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后將玻片取出放入自制的灌流槽中，按1∶2 000比例加入DAF-FM DA熒光探針稀釋液稀釋DAF-FM DA，37℃孵育細(xì)胞20 min后，用2 mmol/L含鈣液沖洗3次后將灌流槽放于熒光顯微鏡上，用495 nm激發(fā)波長，515 nm發(fā)射波長，實時檢測2 mmol/L精胺刺激前后熒光的強(qiáng)弱變化，并通過IPA Software進(jìn)行分析。NO相對熒光強(qiáng)度計算公式如下:NO含量=［測定孔曲線最高相對熒光強(qiáng)度(relative fluorescence unit，RFU)-最低RFU］-(空白孔曲線最高RFU-最低RFU)，每組實驗重復(fù)3次。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，有顯著差異者兩組間均數(shù)比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 激光共聚焦顯微鏡下觀察shRNA成功轉(zhuǎn)染HUVECs

細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的shOrai3后，激光共聚焦顯微鏡下觀察可見成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)發(fā)出紅色熒光，可反映轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后加入G418穩(wěn)篩后，可獲取90%以上的陽性克隆細(xì)胞，見圖1。

Figure 1.Cy3-labelled shOrai3-transfected HUVECs(×20).A:the HUVECs profile under nature light;B:Cy3-labelled red fluorescence in HUVECs;C:merged image.Scale bar=50 μm.圖1 Cy3標(biāo)記的shOrai3轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞

2 Real-time RT-PCR檢測HUVECs中Orai3 mRNA的表達(dá)及shOrai 3的干擾效率

同一代HUVECs分為3組:即空白對照組(control組)、空質(zhì)粒組(vehicle組)和實驗組(shOrai3-75、shOrai3-76和shOrai3-77組)。各轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染48 h后用G418進(jìn)行穩(wěn)篩7 d后提取總mRNA，采用real-time RT-PCR檢測Orai3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染各組與control組相比，可見vehicle組mRNA表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，其余各轉(zhuǎn)染組mRNA的表達(dá)均有降低，尤其是shOrai3-77組中Orai3 mRNA表達(dá)顯著降低(抑制率為84.5%，P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Expression of Orai3 mRNA in HUVECs and interference efficiency of shOrai3.Mean±SEM.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle group.圖2 各轉(zhuǎn)染組HUVECs中Orai3 mRNA的表達(dá)及shOrai3的干擾效率

3 免疫印跡技術(shù)檢測Orai3的蛋白表達(dá)及shOrai3的干擾效率

提取轉(zhuǎn)染48 h、用 G418(200 mg/L)進(jìn)行篩選7 d后HUVECs的總蛋白，轉(zhuǎn)染各組與control組相比，可見 vehicle組的 Orai3蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，其余各轉(zhuǎn)染組蛋白的表達(dá)均有降低，尤其是shOrai3-77組中Orai3的蛋白表達(dá)顯著降低(抑制率為70.68%，P＜0.05)，見圖3。

4 不同處理因素對HUVECs中［Ca2+］i和NO生成的影響

4.1 Orai3基因沉默使CaR激動劑精胺誘導(dǎo)的HUVECs中［Ca2+］i和NO生成減少 選取干擾效率最高的shOrai3-77組為特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組即實驗組(即精胺+Ca2++shOrai3-77組)，另設(shè)未轉(zhuǎn)染組即空白對照組(control組，即精胺+Ca2+組)和空質(zhì)粒組(vehicle-Orai3組，即精胺 +Ca2++vehicle-Orai3組)，將3組細(xì)胞接種于圓形玻片上，待HUVECs生長融合至80%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后將玻片取出，放入灌流槽中測定加精胺刺激后［Ca2+］iΔratio值和NO熒光強(qiáng)度值的變化。與空白對照組及空質(zhì)粒組相比，實驗組［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值明顯降低(P＜0.05)，而空質(zhì)粒組與空白對照組相比［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值無顯著差異(P＞0.05)，說明shRNA沉默Orai3基因，能夠使CaR經(jīng)SOC和ROC介導(dǎo)的［Ca2+］i和NO生成減少，見圖 4、5。

Figure 3.Expression of Orai3 protein in HUVECs and inhibitory efficiency of shOrai3.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle group.圖3 各轉(zhuǎn)染組HUVECs中Orai3蛋白的表達(dá)及shOrai3的抑制效率

Figure 4.Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity after CaR agonist spermine treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖4 CaR激動劑精胺刺激HUVECs后各轉(zhuǎn)染組中Ca2+熒光強(qiáng)度的動態(tài)變化

4.2 Orai3基因沉默使ROC模擬劑TPA+CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex 231誘導(dǎo)的HUVECs中［Ca2+］i和NO生成減少 將細(xì)胞分為實驗組(即Calhex 231+TPA+精胺+Ca2++shOrai3-77組)、空白對照組(control組，即 Calhex 231+TPA+精胺 +Ca2+組)和空質(zhì)粒組(vehicle-Orai3組，即 Calhex 231+TPA+精胺+Ca2++vehicle-Orai3組)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，與空白對照組及空質(zhì)粒組相比，實驗組中［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值明顯降低(P＜0.05)，而空質(zhì)粒組與空白對照組相比［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值無顯著差異(P＞0.05)，說明shRNA沉默Orai3基因，能夠使CaR經(jīng)ROC介導(dǎo)的［Ca2+］i和 NO 生成減少，見圖6、7。

4.3 Orai3基因沉默使PKC抑制劑Ro31-8220介導(dǎo)的HUVECs中［Ca2+］i和NO生成減少 將細(xì)胞分為實驗組(即Ro31-8220+精胺+Ca2++shOrai3-77組)、空白對照組(control組，即Ro31-8220+精胺+Ca2+組)和空質(zhì)粒組(vehicle-Orai3組，即Ro31-8220+精胺+Ca2++vehicle-Orai3組)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，與空白對照組及空質(zhì)粒組相比，實驗組中［Ca2+］iΔratio值和 NO凈熒光強(qiáng)度值明顯降低(P＜0.05)。而空質(zhì)粒組與空白對照組相比［Ca2+］iΔratio值和 NO凈熒光強(qiáng)度值無顯著差異(P＞0.05)，說明shRNA沉默Orai3基因，能夠使CaR經(jīng)SOC介導(dǎo)的［Ca2+］i和NO生成減少，見圖8、9。

Figure 5.Dynamic changes of NO fluorescence intensity after CaR agonist spermine treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖5 CaR激動劑精胺刺激HUVECs后各轉(zhuǎn)染組中NO熒光強(qiáng)度的動態(tài)變化

Figure 6.Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity after CaR negative allosteric modulator Calhex 231 plus ROC analogue TPA treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖6 ROC模擬劑TPA+CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex 231刺激HUVECs后各轉(zhuǎn)染組中Ca2+熒光強(qiáng)度的動態(tài)變化

Figure 7.Dynamic changes of NO fluorescence intensity after CaR negative allosteric modulator Calhex 231 plus ROC analogue TPA treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖7 ROC模擬劑TPA+CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex 231刺激HUVECs后各轉(zhuǎn)染組中NO熒光強(qiáng)度的動態(tài)變化

4.4 Orai3基因沉默使經(jīng)典型PKCs和PKCμ抑制劑 Go6967介導(dǎo)的HUVECs中［Ca2+］i和NO生成減少 將細(xì)胞分為實驗組(即Go6976+精胺+Ca2++shOrai3-77組)、空白對照組(control組，即Go6976+精胺 +Ca2+組)和空質(zhì)粒組(vehicle-Orai3組，即Go6976+精胺+Ca2++vehicle-Orai3組)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，與空白對照組及空質(zhì)粒組相比，實驗組中［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值明顯降低(P＜0.05)，而空質(zhì)粒組與空白對照組相比［Ca2+］iΔratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值無顯著差異(P＞0.05)，說明shRNA沉默Orai3基因，能夠使CaR經(jīng)SOC介導(dǎo)的［Ca2+］i和 NO 生成減少，見圖10、11。

討 論

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)最普遍和最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信息，并且調(diào)控多種生命過程，如細(xì)胞的收縮、增殖、分化與凋亡等［7］。無論在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外執(zhí)行功能，Ca2+必須首先達(dá)到或維持一定濃度，并且在細(xì)胞內(nèi)外維持一定的濃度差。各種信號分子、電壓依賴性鈣通道、ROC、SOC等在［Ca2+］i的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，包括由CaR介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放和由各類通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流兩部分。CaR調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放使［Ca2+］i升高，其速度快但是維持時間短，而細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流則可使［Ca2+］i持續(xù)升高，可以調(diào)節(jié)長期細(xì)胞效應(yīng)，如細(xì)胞生長、分化及細(xì)胞內(nèi)NO的生成等，因此細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信息方面更為重要［8］。以往研究大多只關(guān)注細(xì)胞內(nèi)鈣釋放對［Ca2+］i及 NO生成的影響［6］，而細(xì)胞內(nèi)鈣池持續(xù)釋放有賴于外Ca2+內(nèi)流對細(xì)胞內(nèi)鈣池的重新填充，且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在HUVECs中CaR激活引發(fā)持續(xù)Ca2+內(nèi)流是NO生成重要條件［4-5］，但參與Ca2+內(nèi)流關(guān)鍵分子組件尚不清楚。

Figure 8.Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity after PKA inhibitor Ro31-8220 treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖8 PKC抑制劑Ro31-8220刺激HUVECs后各轉(zhuǎn)染組中Ca2+熒光強(qiáng)度的動態(tài)變化

Figure 9.Dynamic changes of NO fluorescence intensity after PKA inhibitor Ro31-8220 treatment in different transfected HUVEC.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3group.圖9 PKC抑制劑Ro31-8220刺激HUVECs后各轉(zhuǎn)染組中NO熒光強(qiáng)度的動態(tài)變化

Figure 10.Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity after PKCs and PKCμ inhibitor treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖10 經(jīng)典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6967刺激HUVECs后各轉(zhuǎn)染組中Ca2+熒光強(qiáng)度的動態(tài)變化

Figure 11.Dynamic changes of NO fluorescence intensity after PKCs and PKCμ inhibitor treatment in different transfected HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vehicle-Orai3 group.圖11 經(jīng)典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6967刺激HUVECs后各轉(zhuǎn)染組中NO熒光強(qiáng)度的動態(tài)變化

有研究表明在HEK293細(xì)胞株、T淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中都有Orai1、Orai2和 Orai3 mRNA表達(dá)，其中，Orai1是介導(dǎo)SOC的主要分子組成部分，3種Orai以同源二聚體、同源多聚體和異源多聚體形式存在于細(xì)胞膜上［9］。此外，雖然Orai1、Orai2和Orai3在序列上高度同源，但它們所表現(xiàn)出的功能特點有著很明顯的區(qū)別。Lis等［10］采用 Orai2和 Orai3與STIM1共表達(dá)的方法發(fā)現(xiàn)，Orai2和Orai3與STIM1共同異位表達(dá)時均能形成Ca2+通道并且顯示出類似于Orai1與STIM1的共表達(dá)產(chǎn)生的Ca2+釋放激活的鈣電流的電生理特性。然而兩者在其激活和失活的動力學(xué)、對一價離子的滲透和對SOC抑制劑2-氨乙氧基二苯基硼酸鹽(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)的反應(yīng)上都有所不同，50 μmol/L 2-APB能夠抑制Orai1與 STIM1介導(dǎo)的 Ca2+電流，但能激活Orai3與 STIM1介導(dǎo)的 Ca2+電流。Faouzi等［11］研究表明乳腺癌組織中Orai3表達(dá)上調(diào)，并通過絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路激活c-myc基因，在乳腺癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展調(diào)控中起著重要作用。Motiani等［12］研究顯示Orai3的高表達(dá)可促進(jìn)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞增殖;與此同時有學(xué)者指出Orai3參與了血管平滑肌重塑以及血管損傷所致的新生內(nèi)膜增生［13］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)HUVECs中CaR為功能性表達(dá)，并證實CaR在介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流、eNOS活性和NO生成中起著重要作用［14］，且SOC與ROC是以協(xié)同方式參與CaR介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流及NO生成。而鈣通道相關(guān)蛋白Orai3是否為其關(guān)鍵分子組件尚不清楚。本研究首先采用脂質(zhì)體法將設(shè)計好的shRNA包裹轉(zhuǎn)染到HUVECs中，將篩選出來的抑制效率最高的shRNA轉(zhuǎn)染HUVECs，在保證沉默Orai3基因有效抑制Orai3表達(dá)前提下，以精胺與原代培養(yǎng)HUVECs共孵育激活CaR為細(xì)胞模型，首先證實了在HUVECs中沉默Orai3后對 CaR介導(dǎo)的［Ca2+］i升高和 NO生成均有抑制作用，此抑制效應(yīng)由shRNA特異抑制Orai3基因表達(dá)所介導(dǎo)。而后又以ROC模擬劑TPA+CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑 Calhex 231、PKC抑制劑Ro31-8220及經(jīng)典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6967共孵育HUVECs為細(xì)胞模型，通過分別激活SOC或ROC最終證明在精胺刺激激活CaR介導(dǎo)［Ca2+］i和NO的生成過程中，Orai3既作為SOC的關(guān)鍵組件，又作為ROC的關(guān)鍵組件參與了CaR介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流及NO生成。

綜上所述，本研究以HUVECs為研究對象，通過RNAi沉默 HUVECs中Orai3的表達(dá)，成功構(gòu)建了Orai3基因的shOrai3，并為后續(xù)相關(guān)Orai3功能的研究打下了基礎(chǔ)，亦證明了Orai3為CaR經(jīng)SOC、ROC途徑介導(dǎo)鈣內(nèi)流和NO生成的關(guān)鍵組件之一?；谀壳拔墨I(xiàn)報道的CaR在調(diào)節(jié)血管張力、心肌肥厚、動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷等心血管生理和病理生理過程中的重要作用，無疑本研究結(jié)論將為進(jìn)一步闡明CaR導(dǎo)致鈣超載和血管內(nèi)皮功能障礙及在相關(guān)心血管疾病發(fā)病中作用和機(jī)制提供重要理論基礎(chǔ)，并為其防治提供新靶標(biāo)。

(致 謝:衷心感謝華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系/衛(wèi)生部呼吸疾病重點實驗室提供實驗條件和技術(shù)指導(dǎo)。)

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