陽小雅， 劉 梅， 伍嘉寶， 賴周易， 汪 源，

范愛輝4， 朱林燕2， 毛建文5， 王立偉3△， 陳麗新2△

凋亡性細胞皺縮(apoptotic volume decrease，AVD)是細胞凋亡的普遍特征，在細胞凋亡早期觸發(fā)機制中起關(guān)鍵作用［1］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，抗癌藥順鉑(cisplatin;即順式二氨基二氯鉑，cis-diamminedichloroplatinum，cDDP)可誘導低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞AVD和細胞凋亡的發(fā)生，氯通道阻斷劑對其具有阻抑作用。在此基礎上我們進一步用膜片鉗方法觀察到順鉑在等滲環(huán)境下激活氯電流，該電流具有外向整流、對胞內(nèi)ATP具有依賴性、能被氯通道阻斷劑阻斷、陰離子通透性順序為I－≥Br－＞Cl－＞gluconate等特性［2］，提示了順鉑可激活氯通道，該通道參與了AVD和細胞凋亡的發(fā)生。然而，氯離子通道有電壓依賴性氯通道、配體門控性氯通道、蛋白激酶或核苷酸介導的氯通道、容積敏感性氯通道、鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels，CaCC)等幾種類型［3］，順鉑激活的氯通道屬于何種氯通道尚未明確。研究表明，容積敏感性氯通道和CaCC激活后擁有部分與順鉑激活的氯電流相似的電流特征，如外向整流特性、能被氯通道阻斷劑阻斷、相似的陰離子通透性等，且兩者皆參與了細胞凋亡的調(diào)控［4-6］。為進一步明確順鉑激活的氯通道的類型，本研究擬在前期研究基礎上，通過去除細胞內(nèi)外的Ca2+、胞外灌流鈣通道阻斷劑及改變胞外灌流液滲透壓等方法辨明順鉑激活的氯通道是否為CaCC。

材料和方法

1 細胞培養(yǎng)

低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞用含10%小牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的RPMI-1640生長液在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按常規(guī)方法傳代。

2 膜片鉗全細胞記錄

采用我們前文報道的方法記錄全細胞電流［7］。用EPC-7膜片鉗放大器(List Electronic)記錄單個CNE-2Z細胞的全細胞電流。充灌電極內(nèi)液后微電極尖端電阻為5～10 MΩ。電流與電壓信號用CED 1401(Cambridge，UK)數(shù)字化(采樣頻率3 kHz)，實驗數(shù)據(jù)用EPC軟件分析。在電壓鉗制模式下，細胞被鉗制在0 mV，以0 mV、±40 mV和±80 mV順序不斷反復循環(huán)，每一電位持續(xù)200 ms，兩電位之間間隔4 s。所有實驗在室溫(20～24℃)中進行。

在鈣通道阻斷劑實驗中，當順鉑激活氯電流達到峰值并平穩(wěn)2 min后，加入鈣通道阻斷劑，觀察鈣通道阻斷劑對順鉑激活氯電流的影響。

在觀察順鉑激活氯通道的容積敏感性實驗中，當順鉑激活氯電流達到峰值并穩(wěn)定后，換為含相同濃度順鉑的高滲灌流液，待氯電流達到最小值并平穩(wěn)，計算滲透性細胞容積縮小對順鉑激活氯電流的抑制率。計算公式為:抑制率 (%)=［(CCtrl－CIso)－(CHyper－CIso)］/(CCtrl－CIso)×100%，其中 CCtrl是加入順鉑等滲灌流液時的對照電流密度，CIso是等滲時的電流密度，CHyper是加入含順鉑高滲液后的電流密度。

3 溶液及試劑

3.1 灌流液 等滲灌流液含(mmol/L):70 NaCl，2 CaCl2，0.5 MgCl2，10 HEPES 和 140 D-mannitol。用D-mannitol調(diào)節(jié)滲透壓至300 mOsmol/L。高滲灌流液除D-mannitol為280 mmol/L外，其余成分均同等滲灌流液，其滲透壓為440 mOsmol/L。無鈣等滲灌流液在等滲灌流液基礎上去除CaCl2并加入2 mmol/L EGTA。灌流液用Tris液調(diào)pH至7.4。用冰點滲透壓計(Osmomat 030)檢測溶液滲透壓。

3.2 電極內(nèi)液 電極內(nèi)液含(mmol/L):70 N-methyl-D-glucamine chloride(NMDG-Cl)、1.2 MgCl2、1 EGTA、10 HEPES、140 D-mannitol和 2 ATP。Tris液調(diào)pH至7.25，滲透壓調(diào)至300 mOsmol/L。無鈣電極內(nèi)液在電極內(nèi)液的基礎上加入5 mmol/L EGTA，其它成分與電極內(nèi)液相同。

3.3 主要試劑 順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，使用前按需用各種灌流液稀釋。硝苯地平(nifedipine)購自 Sigma，在實驗當天新鮮配制，用DMSO溶解配制成5 mmol/L儲存液，室溫避光保存;灌流前再用灌流液稀釋至1、5和10 μmol/L。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，用方差分析(ANOVA)檢驗均數(shù)差異顯著性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 細胞外無Ca2+對順鉑激活氯電流的影響

如圖1A所示，當細胞處于無Ca2+等滲灌流液中時，可記錄到較小且穩(wěn)定的細胞背景電流。當灌流5 μmol/L順鉑無 Ca2+等滲灌流液時，在(435.7±100.1)s時能激活一電流，該電流逐漸增大，約(1 175.6±221.5)s達到峰值，內(nèi)向和外向電流在 ±80 mV鉗制下平均密度約為(－72.0±14.1)pA/pF和(93.1 ±14.5)pA/pF(P ＜0.01)，見圖1B、D、E。當電流達到峰值并穩(wěn)定后，灌流液換成5 μmol/L順鉑含Ca2+等滲灌流液，電流出現(xiàn)小幅度上升，達到平臺期時電流大小為(－86.5±15.2)pA/pF(－80 mV)和(117.6 ±14.1)pA/pF(+80 mV)，但與無 Ca2+時激活的電流相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖1C、E。

Figure 1.Effects of extracellular calcium depletion on the activation of cDDP-activated Cl－ currents in CNE-2Z cells.A:traces of background currents recorded in the Ca2+free isotonic solution;B:currents recorded in the Ca2+-free cDDP solution;C:a typical time course of the currents induced by cDDP in the absence or presence of extracellular Ca2+;D:currents recorded in the cDDP solution;E:the current-voltage relationships of the cDDP-activated currents in the absence or presence of extracellular Ca2+.Iso(Ca2+-free):Ca2+-free isotonic condition;cDDP(Ca2+-free):Ca2+-free cDDP solution challenge;cDDP:cDDP solution challenge.Mean ± SEM.n=9.＊＊P ＜0.01 vs Iso(Ca2+-free)group.圖1 細胞外無Ca2+對順鉑激活的CNE-2Z細胞電流的影響

上述結(jié)果顯示，順鉑在細胞外有Ca2+與無Ca2+條件下均可激活氯電流，且電流大小無明顯差別，證實順鉑激活氯電流不依賴于細胞外Ca2+。然而，順鉑在細胞外無Ca2+時激活氯電流的潛伏期比細胞外有Ca2+時延長(P＜0.01)，達峰時間也增加(P＜0.05)，見表1，提示Ca2+在順鉑激活氯電流過程中可能通過某種途徑起調(diào)節(jié)作用。

表1 順鉑在細胞外無Ca2+與正常狀態(tài)下激活氯電流的潛伏期及達峰時間Table 1.Latency and peak time of cDDP-activated chloride currents in the absence or presence of extracellular Ca2+(Mean±SD.n=9)

2 細胞內(nèi)無Ca2+和細胞內(nèi)外均無Ca2+對順鉑激活氯電流的影響

如圖2A所示，在－80 mV電壓鉗制下，內(nèi)向電流峰值的電流密度為(－85.7±30.1)pA/pF，+80 mV電壓鉗制下，外向電流的電流密度為 (93.2±28.5)pA/pF，與正常細胞內(nèi)外含Ca2+情況下激活的電流密度相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。當細胞內(nèi)外均無Ca2+時，順鉑激活氯電流的潛伏期為(296.3 ±66.1)s，與含 Ca2+對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，達峰時間為(1 087.5 ±135.2)s，較含Ca2+對照組延長(P＜0.05)。當電流達峰并穩(wěn)定后，灌流液換成順鉑含Ca2+等滲灌流液，形成了細胞內(nèi)無Ca2+狀態(tài)，此時電流變化不明顯，如圖2B和2C所示，達到平臺期時電流大小為(－86.0±37.7)pA/pF(－80 mV)和(97.8 ±40.9)pA/pF(+80 mV)，與細胞內(nèi)外均含Ca2+的對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，順鉑激活氯電流不依賴于細胞內(nèi)的Ca2+。

Figure 2.Effects of intra/extracellular calcium depletion on the activation of cDDP-activated Cl－ currents in CNE-2Z cells.A:currents recorded in the Ca2+-free cDDP solution with 5 mmol/L EGTA in the pipette solution;B:currents recorded in the cDDP solution with 5 mmol/L EGTA in the pipette solution;C:the current-voltage relationships of the cDDP-activated currents under the intra/extracellular calcium depletion conditions.Iso(Ca2+-free):Ca2+-free isotonic condition;cDDP(intraand extracellular Ca2+-free):Ca2+-free cDDP solution with 5 mmol/L EGTA in the pipette solution;cDDP(intracellular Ca2+-free):cDDP solution with 5 mmol/L EGTA in the pipette solution.Mean ± SEM.n=9.圖2 細胞內(nèi)無Ca2+、細胞內(nèi)外均無Ca2+對順鉑激活的CNE-2Z細胞電流的影響

3 鈣通道阻斷劑對順鉑激活氯電流的影響

結(jié)果顯示 1 μmol/L 和5 μmol/L nifedipine不能抑制順鉑激活的氯電流。圖3A和B分別顯示了順鉑激活的氯電流和5 μmol/L nifedipine的抑制作用瞬時圖。－80 mV電壓鉗制下，內(nèi)向電流從 (－75.0±12.4)pA/pF 略減小到(－73.0 ±13.1)pA/pF，抑制率為(4.2 ±3.9)%(P ＞0.05);+80 mV 電壓鉗制下，外向電流從 (86.9±13.3)pA/pF減小到(79.6 ± 13.9)pA/pF，抑制率為(10.8 ± 3.1)%(P＞0.05)，見圖 3C。增大 nifedipine 濃度至 10 μmol/L，抑制率無進一步增大。

Figure 3.Effects of calcium channel antagonist nifedipine on the cDDP-activated Cl－ currents in CNE-2Z cells.A:traces of the currents induced by cDDP;B:current traces showing effect of nifedipine on the cDDP-activated Cl－currents;C:the currentvoltage relationships under cDDP-activated condition and extracellular nifedipine(5 μmol/L)treatment.Iso:isotonic condition;cDDP:cDDP challenge;nifedipine:nifedipine treatment after cDDP challenge.Mean ± SEM.n=7.圖3 鈣通道阻斷劑nifedipine對順鉑激活氯電流的影響

4 順鉑激活氯電流的容積敏感性

如圖4A所示，47%高滲灌流液可迅速完全抑制順鉑激活的氯電流。此抑制作用是可逆的，換回等滲灌流液可見氯電流恢復。圖2B和C分別顯示了順鉑激活的氯電流和高滲灌流液抑制作用的瞬時圖。在鉗制電壓為－80 mV時，47%高滲灌流液使順鉑激活的內(nèi)向電流從 (－50.0±7.7)pA/pF減小到(－8.5 ±2.5)pA/pF，抑制率為 (91.8 ±3.6)%(P＜0.01)，在鉗制電壓為+80 mV時，外向電流從(60.5 ±10.5)pA/pF 減小到(8.9 ±2.4)pA/pF，抑制率為(91.3 ±4.2)%(P ＜0.01)。47%高滲灌流液對外向電流和內(nèi)向電流的抑制率差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖4D，表明順鉑激活的氯電流對容積變化敏感。

討 論

CaCC在組織中分布廣泛，在體內(nèi)多種生命活動中扮演著重要角色，如嗅覺、味覺的轉(zhuǎn)導、神經(jīng)元的興奮性、腺體和上皮細胞分泌、平滑肌收縮、細胞增殖及凋亡等［4，8-9］。CaCC 激活后的電流ICl(Ca)呈現(xiàn)出外向整流特性、離子選擇性順序為 SCN－＞I－＞NO3－＞Br－＞Cl－＞F－＞gluconate、能被傳統(tǒng)的氯通道阻斷劑如tamoxifen等所阻斷等特性［10］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，抗癌藥順鉑能在數(shù)分鐘內(nèi)誘導低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞產(chǎn)生氯電流，該電流同樣具有外向整流、能被氯通道阻斷劑tamoxifen阻斷、陰離子通透性順序為 I－≥Br－＞Cl－＞gluconate等特征［2］，與ICl(Ca)呈現(xiàn)的部分特征相似。［Ca2+］i的升高是激活CaCC的必要條件，胞內(nèi)鈣庫 Ca2+的釋放、胞外Ca2+內(nèi)流與 Na+/Ca2+交換均可使［Ca2+］i升高［8］。然而，本實驗結(jié)果表明，在細胞外無Ca2+或細胞內(nèi)外均無Ca2+的情況下，順鉑均能激活氯電流，該電流大小與有Ca2+存在時激活的電流大小相同，表明順鉑誘導的氯電流不依賴于細胞內(nèi)/外的Ca2+，提示該通道不是CaCC。另有報道顯示，鈣通道阻斷劑米拉地爾(mibefradil)［3］能有效抑制 ICl(Ca)，而本實驗結(jié)果顯示，在CNE-2Z細胞，鈣通道阻斷劑nifedipine不能抑制順鉑激活的氯電流，進一步說明順鉑激活的氯通道非CaCC。

Figure 4.Effects of extracellular hypertonic condition on cDDP-activated chloride currents in CNE-2Z cells.A:the time course of the cDDP-activated currents inhibited by the hypertonic solution;B:currents recorded in the cDDP isotonic solution;C:currents recorded in the cDDP hypertonic solution;D:the current-voltage relationships of the cDDP-activated currents in the isotonic or hypertonic conditions.Iso:isotonic condition;cDDP:cDDP solution challenge;cDDP+Hyper:cDDP hypertonic solution challenge.Mean ± SEM.n=6.＊＊P ＜0.01 vs cDDP group.圖4 細胞外高滲對順鉑激活氯電流的影響

容積敏感性氯通道為最常見的陰離子通道，在細胞容積調(diào)節(jié)［11］、細胞遷移［12］、細胞周期［13］、細胞增殖［13-14］等生命活動中發(fā)揮重要作用。近年研究表明，容積敏感性氯通道通過參與AVD的發(fā)生而參與細胞凋亡［5-6，14］。容積敏感性氯電流部分的電流特征與ICl(Ca)相似，如外向整流特性、相似的陰離子通透性、均能被傳統(tǒng)的氯通道阻斷劑所阻斷等，此外，容積敏感性氯電流亦擁有自己獨特的特征，如對胞內(nèi)ATP的依賴性及對容積變化敏感［7］。我們的前期研究表明，順鉑誘導的氯電流擁有與容積敏感性氯電流相似的特征，為進一步探討該電流對細胞容積改變是否敏感，我們在順鉑等滲灌流液激活氯電流的情況下給予高滲刺激，實驗結(jié)果顯示，該電流可被明顯抑制，說明該電流具有容積敏感性，提示在CNE-2Z細胞中，順鉑激活的氯通道可能是容積激活氯通道，而非CaCC。在表皮樣腺癌KB細胞［5］及野生型人肺腺癌細胞(WT A549細胞)［6］中，順鉑也能引出與容積敏感性氯電流特征相似的電流，進一步提示了順鉑激活的氯通道很可能是容積激活氯通道，但還需利用特異性阻斷劑以及其它手段研究證實。

Ca2+在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用。本實驗中，盡管在細胞外無Ca2+的情況下，順鉑激活的氯電流大小與胞外有Ca2+時激活的電流大小相同，然而，其激活時間與達峰時間均延長，提示了雖然氯通道的激活不依賴于Ca2+，但細胞外Ca2+在其激活過程中可能起調(diào)節(jié)作用。我們實驗室的前期研究顯示，胞外無Ca2+或加入鈣離子阻斷劑nifedipine均可延緩順鉑誘導CNE-2Z細胞AVD的發(fā)生［15］，提示細胞外Ca2+內(nèi)流可能在觸發(fā)細胞凋亡早期AVD中對氯通道的激活起重要調(diào)節(jié)作用，但并非氯通道激活所必須的條件。細胞外Ca2+進入細胞的途徑主要有Na+/Ca2+交換、通過鈣通道內(nèi)流入胞內(nèi)等［8］，本實驗結(jié)果顯示，鈣通道阻斷劑nifedipine不能抑制順鉑激活的氯電流，提示Ca2+不是通過鈣通道途徑進入細胞而起作用。細胞外Ca2+是否通過Na+/Ca2+交換或通過其它途徑進入細胞而調(diào)節(jié)氯通道的激活則有待進一步探討。

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