郝乘儀，吳艷玲，廉麗花，南極星

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 132013;2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，延吉 133002)

刺五加[Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxin.)Hams]為多年生硬質(zhì)灌木，由于含有多種天然活性成分，且無(wú)毒副作用，自古就倍受人們青睞，距今具有兩千多年的應(yīng)用歷史，《本草綱目》稱(chēng)其為“本中上品”，具“補(bǔ)中益氣、堅(jiān)筋骨強(qiáng)意志、久服輕身耐老”功效。近年來(lái)研究證明，刺五加和人參具有相似的藥理作用和臨床療效，可增加機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體對(duì)各種有害刺激非特異性的抵抗力和抗癌作用[1]。肝臟是藥物和毒物代謝過(guò)程中的重要器官，日常生活中過(guò)量飲酒或飲用中藥都會(huì)引發(fā)肝臟的損傷[2-4]。刺五加對(duì)肝臟有較好的保護(hù)作用，但是對(duì)其研究還比較少，而且多是提取物的研究[5-6]，筆者在本實(shí)驗(yàn)利用刺五加中的有效成分刺五加酸證明其具有很好的保肝作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 取雄性SPF級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量20～22 g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物科提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(吉)2008-5110，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(吉)2008-0003，25℃恒溫環(huán)境飼養(yǎng)，飼標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.2 藥品與試劑 他克林(Sigma公司);刺五加酸由韓國(guó)生命工學(xué)研究院李晶俊博士提供，純度98%;N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC，Sigma公司);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒、蘇木精染劑(批號(hào):20101215)均購(gòu)自南京建成生物研究所;甲醛溶液(天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng))。

1.3 儀器 HJ-2雙頭磁力加熱攪拌器(金壇市科析儀器有限公司)，SUNRISE酶標(biāo)儀(上海麥莎生物科技有限公司)，MDF-U4186S超低溫冰箱(三洋電機(jī)國(guó)際貿(mào)易有限公司)，BS224型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，SP-4430型生化分析儀(日本ARKRAY公司)，1-13型離心機(jī)(Sigma公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及肝損傷模型制作 雄性小鼠60只，隨機(jī)分成6組，即正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組(NAC 300 mg·kg－1)，刺五加酸小、中、大劑量組(50，100，200 mg·kg－1)，每組 10 只。正常對(duì)照組與模型對(duì)照組灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液。其余4組連續(xù)灌胃給予相應(yīng)藥物，共3 d，末次給藥前禁食16 h，給藥1h后除正常對(duì)照組外均灌胃給予他克林35 mg·kg－1，6 h后頸動(dòng)脈取血，分離肝臟，脫頸椎處死，收集血清，肝臟存放于－80℃冰箱中，備用[7]。

1.4.2 指標(biāo)測(cè)定 取小鼠頸動(dòng)脈血，靜置15 min后，以3000 r·min－1離心 15 min后，取出血清，置于－20℃下冷凍保存，以備用。血清中 ALT、AST和LDH測(cè)定:以SP-4430型生化分析儀按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。肝臟組織中GSH、MDA的測(cè)定依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 病理組織學(xué)檢查 取肝臟左葉距邊緣0.5 cm處小塊組織，用10%甲醛溶液固定，按常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后顯微鏡下觀(guān)察組織形態(tài)學(xué)(蘇木精-伊紅染色)。肝細(xì)胞脂肪變性程度和壞死及炎癥活動(dòng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)分為:0分，無(wú)變性、壞死;1分，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴極稀少，一個(gè)或者幾個(gè)壞死細(xì)胞;2分，輕微病變，10% ～25%壞死細(xì)胞或炎細(xì)胞浸潤(rùn);3分，中度病變，～40%壞死細(xì)胞或炎細(xì)胞浸潤(rùn);4分，明顯病變，～50%壞死細(xì)胞或炎細(xì)胞浸潤(rùn);5分，嚴(yán)重病變，＞50%壞死細(xì)胞或炎細(xì)胞浸潤(rùn)[8]。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad prism program 5.0 版軟件(Graphpad software，Inc，san Diego，USA)分析，用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Turkey＇s多因素 t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)他克林所致急性肝損傷大鼠AST ALT及LDH的影響 給予他克林后，模型對(duì)照組的ALT、AST以及LDH含量明顯升高，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明造模成功。各給藥組ALT、AST以及LDH含量下降，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01或 P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 病理組織學(xué)觀(guān)察 正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，刺五加酸小、中、大劑量組肝損傷的評(píng)分分別為 0.0，4.2，2.3，2.9，2.2，1.8 分。正常對(duì)照組的肝組織完好，肝細(xì)胞完整，細(xì)胞核正常;模型對(duì)照組表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)大部分破壞，肝細(xì)胞呈彌漫性壞死，細(xì)胞核固縮或消失，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);刺五加酸小劑量組細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，壞死性區(qū)域與模型對(duì)照組相比有所減少;刺五加酸中劑量組肝索排列接近正常，部分肝細(xì)胞體積增大，中央靜脈及匯管區(qū)清晰可見(jiàn);刺五加酸大劑量組肝細(xì)胞完整，部分肝細(xì)胞增大，與正常對(duì)照組接近。見(jiàn)圖1。

2.3 對(duì)他克林所致急性肝損傷大鼠MDA、GSH的影響 給予他克林6 h后，模型對(duì)照組MDA含量明顯升高，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，刺五加酸中劑量組、大劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組MDA含量均明顯降低，與模型對(duì)照組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)，刺五加酸大劑量組與中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。模型對(duì)照組GSH含量明顯降低，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，刺五加酸大劑量組和中劑量組GSH含量明顯升高，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，刺五加酸大劑量組與中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 6組小鼠血清中AST、ALT和 LDH的含量比較Tab.1 Comparison of the serum level of AST，ALT and LDH among six groups of mice U·L－1，

表1 6組小鼠血清中AST、ALT和 LDH的含量比較Tab.1 Comparison of the serum level of AST，ALT and LDH among six groups of mice U·L－1，

與正常對(duì)照組比較，*1 P ＜0.01;與模型對(duì)照組比較，*2 P＜0.01，*3 P ＜0.05Compared with normal control group，*1 P ＜0.01;compared with model control group，*2 P ＜0.01，*3 P ＜0.05

組別 小鼠/只 劑量/(mg·kg－1)AST ALT LDH正常對(duì)照組 10 …52±23 14±1 1028±487模型對(duì)照組 10 … 425±85*1 59±7*1 3918±737*1陽(yáng)性對(duì)照組 10 300 149±42*2 26±4*2 1357±421*2刺五加酸小劑量組 10 50 241±37*3 50±3*3 3404±615*3中劑量組 10 100 123±19*2 25±5*2 3251±765*3大劑量組 10 200 143±46*2 32±9*2 1218±312*2

A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.陽(yáng)性對(duì)照組;D.刺五加酸小劑量組;E.刺五加酸中劑量組;F.刺五加酸大劑量組圖1 6組小鼠肝臟病理組織切片圖(×100)A.normal control group;B.model control group;C.positive comtrol group;D.low-dose acanthoic acid group;E.middle-dose acanthoic acid group;F.high-dose acanthoic acid groupFig.1 Histopathologic slide image of livers from six groups of mice(×100)

表2 6組小鼠MDA和GSH的含量比較Tab.2 Comparison of the contents of MDA and GSH among six groups of mice

表2 6組小鼠MDA和GSH的含量比較Tab.2 Comparison of the contents of MDA and GSH among six groups of mice

與模型對(duì)照組比較，*1 P＜0.01;與中劑量組比較，*2 P＜0.05Compared with model control group，*1 P ＜ 0.01;compared with middle dose group，*2 P ＜0.05

組別 小鼠/只劑量/(mg·kg－1)MDA/(μmol·g－1)GSH/(mg·g－1)正常對(duì)照組 10 … 2.80±1.50*1 601±33*1模型對(duì)照組 10 … 7.63±0.50 238±27陽(yáng)性對(duì)照組 10 300 3.01±0.24*1 226±23刺五加酸小劑量組 10 50 5.41±0.72 268±31中劑量組 10 100 3.00±0.55*1 397±21*1大劑量組 10 200 3.24±0.48*1 417±15*1*2

3 討論

他克林是一種膽堿酯酶抑制藥，其化學(xué)名為9-氨基-1，2，3，4-四氫吖啶，是治療老年癡呆癥的一種有效藥物，但其有很強(qiáng)的肝毒性[9]。NAC對(duì)肝損傷有較好療效，其保護(hù)作用可能是通過(guò)補(bǔ)充血清及肝臟組織中所消耗的GSH，并提高血清中一氧化氮來(lái)增強(qiáng)組織灌流，降低肝臟組織中有毒性作用的一氧化氮而產(chǎn)生保護(hù)作用[10-11]。

筆者建立了他克林小鼠肝損傷模型。實(shí)驗(yàn)表明，他克林35 mg·kg－1可引起明顯的小鼠肝毒性，表現(xiàn)為肝臟血清ALT和AST升高。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，刺五加酸灌胃給藥，可顯著改善由他克林所導(dǎo)致的肝損傷。在給藥組中，尤其是刺五加酸中、大劑量組，血清中的AST、ALT含量顯著降低，說(shuō)明刺五加酸具有防止他克林誘導(dǎo)的肝損傷作用。刺五加酸還顯著降低了肝組織中MDA的含量和肝組織中GSH的消耗。提示刺五加酸對(duì)他克林引起的急性肝損傷具有較好的保護(hù)作用。

目前有關(guān)刺五加酸的研究較少，其確切的藥理作用及作用機(jī)制報(bào)道甚少，極具開(kāi)發(fā)研究潛力。

[1]賈繼明，王宏濤，王宗權(quán)，等.刺五加的藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2010，12(2):7 －8.

[2]王君明，崔瑛，王崢濤，等.超氧化物歧化酶參與肝損傷的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(7):265－266.

[3]余瓊?cè)A.42例藥物性肝損害分析[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30(2):256.

[4]霍記平，湯強(qiáng)，胡本容，等.長(zhǎng)期攝入乙醇對(duì)大鼠心血管系統(tǒng)與肝臟的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(11):1420 －1421.

[5]金英順.刺五加對(duì)D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素合用所致小鼠暴發(fā)性肝衰竭的保護(hù)作用[D].延吉:延邊大學(xué)，2005.

[6]馮丹.刺五加注射液對(duì)大鼠肝缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用[D].延吉:延邊大學(xué)，2010.

[7]陳震，呂雄文，李俊，等.咖啡因?qū)π∈蠹毙跃凭愿螕p傷的保護(hù)作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(3):359－362.

[8]WANG A Y，LIAN L H，JIANG Y Z.Gentiana manshurica Kitagawa prevents acetaminophen-induced acute hepatic injury in mice via inhibiting JNK/ERK MAPK pathway[J].World J Gastr，2010，16(3):384 －354.

[9]MENG Q，RU J H.Reevaluation of tacrine hepatotoxicity using gel entrapped hepatocytes[J].Toxi Lett，2007，168(1):140－141

[10]巫國(guó)誼.N-乙酰半胱氨酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D].重慶:重慶醫(yī)科大學(xué)，2004.

[11]李衛(wèi).重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷機(jī)制及NAC對(duì)肝的保護(hù)作用[D].衡陽(yáng):南華大學(xué)，2011.