田華++劉富++劉冰華++高音++曲麗輝

摘 要：目的：旨在觀察葛根素對血管性癡呆小鼠的神經(jīng)保護作用及其機制的探討。方法：通過采用改良的雙側(cè)頸總動脈持久性結(jié)扎法制作血管性癡呆模型，并利用全細胞式膜片鉗技術及分子生物學技術，觀察葛根素對血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元延遲整流鉀電流的影響。結(jié)果：（1）與正常組相比，血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元Ik電流強度下降，下降幅度為14.79%±5.6%（P<0.05）。（2）與模型組相比，葛根素組的Ik電流幅度呈現(xiàn)顯著下降抑制率為（34.48±8.3）%（n=5，P﹤0.01）。（3）Western blot結(jié)果顯示，模型組KV 2.1表達低于正常組（P<0.05）；與正常組和模型組相比，葛根素組KV 2.1的表達量均明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：葛根素可能通過抑制延遲整流鉀電流對血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元發(fā)揮一定的神經(jīng)保護作用。

關鍵詞：葛根素 頂葉皮層 全細胞式膜片鉗技術 延遲整流鉀電流

中圖分類號：G64 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）04（b）-0250-02

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是繼阿爾茨海默病之后第二位最常見的癡呆癥，在我國老年人中尤為常見和多發(fā)。血管性癡呆實際上是指大腦功能衰退，特別是與智能有關的功能全面衰退。造成腦血管性癡呆的主要原因是腦血流量減少， 引起腦組織生化代謝障礙[1-2]。

葛根素（Puerarin，Pur）從葛根中提取出的有效成分，化學名為4，7—一二羥基-8-D葡萄糖基異黃酮，近年對葛根的研究較為深入，目前葛根素被廣泛用于心腦血管疾病等急性期的治療，包括心絞痛、心肌梗塞，心律失常、腦缺血等[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能明顯降低腦梗死患者的梗死灶面積，降低急性腦梗死患者的血流變和提高神經(jīng)功能學評分[4]。各種離子通道的結(jié)構(gòu)和功能異常與心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關，文獻報道，葛根素可不同程度的影響心肌鈉、鉀、鈣離子通道[5-6]。然而對于葛根素的神經(jīng)保護作用機制的研究方法主要集中在利用酶學、形態(tài)學及免疫組化等方面，利用膜片鉗技術考察葛根素其神經(jīng)保護作用的研究較少，唐瑜等利用膜片鉗技術發(fā)現(xiàn)，葛根素可以抑制腦缺血再灌注損傷的大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞L-型鈣通道[7]，但是葛根素對小鼠皮層神經(jīng)元鉀離子通道的作用如何目前仍未見報道。故本實驗擬采用全細胞式膜片鉗技術觀察葛根素對血管性癡呆小鼠頂葉皮層神經(jīng)元延遲整流鉀電流（IK）的調(diào)制作用，從離子通道角度為進一步揭示葛根素防治缺血性腦損傷的可能機制奠定一定的理論基礎。

1 材料和方法

（1）建立動物模型及分組成年昆明小鼠，18～22 g，雌雄不限，由齊齊哈爾醫(yī)學院動物研究中心提供。采用雙側(cè)頸總動脈持久性結(jié)扎法，并對該方法進行改良制作血管性癡呆模型，采用跳臺試驗鑒別血管性癡呆動物模型是否成功建立。模型建立后小鼠隨機分為正常組、模型組和葛根素組，各組立即給予相應藥物。正常組和模型組：腹腔注射生理鹽水，1次/日，注射14天。葛根素組：腹腔注射葛根素注射液（1 mg/mL），1.0 mL/100 g，1次/日，注射14 d。

（2）試劑與儀器 Protease、EGTA 、HEPES均為Sigma公司產(chǎn)品，葛根素注射液（安徽聯(lián)誼藥業(yè)股份有限公司）；β-actin、Kv2.1抗體及其相應二抗購自santa cluz公司，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。IBBMClamp32數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)以及PC-IIC型膜片鉗放大器均由華中理工大學研制。

（3）神經(jīng)元急性分離與全細胞記錄。將小鼠急性斷頭取腦，取頂葉皮質(zhì)，并置于人工腦脊液（ASF）（0～4 ℃）中，將其切成冠狀腦片（厚度約400～500 μm），在預先通好（95% O2+5% CO2）混合氣的ASF（37℃）中孵育30min，之后在含0.5%protease的ASF（37℃）中消化30-35 min，連續(xù)通混合氣并微震蕩腦片。消化結(jié)束后，取2片腦片用0～4℃ASF沖洗3次，用剪刀將組織剪碎成1mm3的組織塊，用尖端拋光的Pasteur吸管吹打并吹散組織塊，靜置3～5 min后，吸取上清液滴于預先備好的細胞外液培養(yǎng)皿中，靜置待細胞貼壁，選取狀態(tài)良好的神經(jīng)元進行全細胞式膜片鉗實驗，首先使電極貼近細胞并形成高阻封接（>1 G?），負壓吸引形成全細胞式，在電壓鉗模式下，將保持電壓（HP）置于-80 MV，首先給予﹣40MV的預刺激，波寬150 ms，隨后給予去極化脈沖刺激（﹣40 MV—+60 MV），階躍電壓10MV，刺激波寬150 ms，以300 ms處的電流值計算IK并觀察其變化。

（4）統(tǒng)計學分析。實驗結(jié)果中IK以300 ms處的電流值統(tǒng)計計算，抑制率計算公式為：（1-IK實驗組/IK對照組）×100%。結(jié)果分析采用SPSS軟件，結(jié)果用（x±SD）表示，t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 葛根素注射液對血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元Ik的抑制作用

急性分離各組小鼠皮層神經(jīng)元，取狀態(tài)良好的神經(jīng)元進行實驗。形成全細胞封接后，以300 ms處的電流值計算IK。記錄的外向電流可被四氨基吡啶（4-AP）（2 μmol/L）和四乙胺（TEA）（10 μmol/L）所抑制，用CSCl替換電極內(nèi)液KCl則不能激活出此外向電流，證實該電流為延遲整流鉀電流并記錄。以在指令電壓+60 mV時電流值進行統(tǒng)計處理，與正常組相比，血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元Ik電流幅度有所下降，下降幅度為（14.79±5.6）%（P<0.05）；與模型組相比，葛根素組的Ik電流幅度呈現(xiàn)顯著下降，抑制率為（34.48±8.3）%（n=5，P﹤0.01）。

2.2 葛根素對血管性癡呆小鼠皮層Kv2.1蛋白表達量的影響

急性分離的各組小鼠頂葉皮層腦組織，用細胞裂解液處理，細胞蛋白溶出，進行蛋白定量，采用Western blot方法，用抗體檢測細胞KV 2.1含量，實驗結(jié)果顯示，正常組、模型組、葛根素組均可見有KV 2.1表達條帶；定量分析顯示，模型組KV 2.1表達低于正常組（P<0.05）；與正常組和模型組比較，而葛根素組KV 2.1的表達量均明顯降低（P<0.01，P<0.05）。endprint

3 討論

腦血管性癡呆與離子通道結(jié)構(gòu)和功能異常之間有著密切的關系，鉀通道是分布最廣、類型最多的一類離子通道，具有種類多、亞型多、性質(zhì)復雜等的特點，幾乎存在于所有的細胞膜上并發(fā)揮著多種生物功能。本實驗中，在電壓為-40 mV時瞬時外向鉀電流已經(jīng)失活，激活的外向電流可以被4-AP和TEA所抑制，此外，若電極內(nèi)液KCl被CsCl替代后則不能激活出此外向電流，因此可證實此外向電流是電壓門控性延遲整流鉀電流。

以往研究主要通過考察葛根素對大、小鼠各腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)、酶類或者神經(jīng)細胞形態(tài)學的影響試圖揭示葛根素對神經(jīng)系統(tǒng)保護作用及機制，如葛根素對缺氧缺糖、谷氨酸鈉引起的體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細胞損傷的保護作用[8]，能減少突觸體鈣超載和神經(jīng)元陽性凋亡細胞出現(xiàn)率， 提示葛根素的抗神經(jīng)細胞凋亡作用與抑制突觸體鈣超載有關[9]。但從離子通道角度探討葛根素的神經(jīng)保護機制，尤其是葛根素對血管性癡呆動物模型離子通道的影響報道較少。

研究表明，腦缺血所致的腦組織損傷可使神經(jīng)元細胞膜鉀通道失活，細胞膜去極化，導致細胞興奮性升高， 致使膜電位不易恢復。IK電流是由延遲整流鉀通道介導的鉀離子外流產(chǎn)生的，能延長動作電位時程，影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，還可參與皮層神經(jīng)元的調(diào)亡過程。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆小鼠腹腔注射葛根素注射液14天后，絕大多數(shù)小鼠的頂葉皮層神經(jīng)元的IK明顯降低，同時分子生物學結(jié)果顯示，葛根素可降低血管性癡呆小鼠頂葉皮層腦區(qū)Kv2.1蛋白的表達。以上結(jié)果與文獻報道一致[10]。本實驗結(jié)果揭示葛根素血管性癡呆小鼠頂葉皮層神經(jīng)元IK有抑制作用，可能會影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，參與機體免疫與炎癥反應過程，調(diào)節(jié)機體在生理或病理條件下的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元退行性變過程中，鉀通道阻斷劑TEA通過阻斷IK電流發(fā)揮保護易感細胞亞群的作用。那么，本實驗發(fā)現(xiàn)葛根素對血管性癡呆小鼠皮層延遲整流鉀電流也存在一定的抑制作用，提示，葛根素可能在神經(jīng)元退行性變過程中也可能發(fā)揮一定的保護易感細胞亞群的作用，但具體機制如何尚不明確，有待進一步研究。

參考文獻

[1] 李梨，周岐新，石京山.血管性癡呆研究概況[J].中國老年學雜志，2005，25（10）： 1269-1271.

[2] 張蓓，吳海琴，張海雄.血管性癡呆的神經(jīng)生化機制[J].國外醫(yī)學腦血管疾病分冊[J].2005，13（9）：672-675.

[3] 趙坤英，解恒革.葛根總黃酮及葛根素對神經(jīng)系統(tǒng)保護作用的研究進展[J].中國醫(yī)藥科學，2011，1（1）：65-67.

[4] 常明則，王新來，吳海琴，等.葛根素對血管性癡呆大鼠行為學及額葉細胞凋亡的影響[J].卒中與神經(jīng)疾病，2009， 16（3）：151-154.

[5] 張亞男，馬津全，王舒.鉀通道與缺血性腦損傷的研究進展[J].中國腦血管病雜志.2012，9（4）：217-220.

[6] 苗維納，沈映君，曾曉榮，等.葛根素對大鼠心肌細胞離子通道的影響[J].中國應用生理學雜志，2002，18（2）：155-158.

[7] 唐瑜，劉馨蓮，樊萌，羅榮敬，周樂全.葛根素抑制腦缺血再灌注損傷的大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞L-型鈣通道[J].基礎醫(yī)學與臨床，2007，27（10）：1172-1174.

[8] 董麗萍，韓明，袁芳，等.葛根素對大鼠星形膠質(zhì)細胞的體外保護作用[J].中國應用生理學雜志，2001，17（2）：141-143.

[9] 高唱，王景周，王琳，等.葛根素對局灶性腦缺血/再灌流大鼠神經(jīng)細胞凋亡的作用[J].中國急救醫(yī)學，2003，23（1）：14-15.

[10] 陳悅，黃霞，衛(wèi)瓊玲.葛根素對豚鼠乳頭肌動作電位及延遲整流鉀電流的影響[J].中國藥學雜志，2006，41（10）：747-749.endprint