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        流感病毒裂解疫苗無(wú)菌檢查法的建立

        2014-11-05 01:09:00北京市藥品檢驗(yàn)所100035王似錦高春
        首都食品與醫(yī)藥 2014年10期
        關(guān)鍵詞:檢查法硫代硫酸鈉稀釋液

        北京市藥品檢驗(yàn)所(100035)王似錦 高春

        疫苗免疫仍然是當(dāng)今預(yù)防流感最有效的手段。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的流感疫苗證明安全有效[1]。流感疫苗是最早進(jìn)行核酸疫苗研究的一種疫苗[2]。流感病毒裂解疫苗是用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的、并經(jīng)國(guó)務(wù)院藥品管理部門批準(zhǔn)的甲型和乙型流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)病毒株分別接種雞胚,經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒、病毒活化,純化、裂解后制成[3]。

        裂解型流感滅活疫苗是建立在流感全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ)上,通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)牧呀鈩┖土呀鈼l件裂解流感病毒,去除病毒核酸和大分子蛋白,保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白,經(jīng)過(guò)不同的聲場(chǎng)工藝取出裂解劑和純化有效成風(fēng)制備而成。目前使用的裂解劑主要包括乙醚、3-N-丁基磷酸鹽(Tri-N-butyl phosphate)、聚山梨酯80(Polysothat 80)、脫氧膽酸鈉(Sodiumdeoxyholate)及三硝基甲苯X100(TritoX100)等,裂解型流感疫苗可降低全病毒滅活疫苗的接種副反應(yīng),并保持相對(duì)較高的免疫原性,可擴(kuò)大疫苗的使用范圍,但在制備過(guò)程中須添加和去除裂解劑[4]。

        中國(guó)藥典2010年版三部附錄[5]要求,只要供試品性狀允許,應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法,并要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。當(dāng)建立產(chǎn)品的無(wú)菌檢查法時(shí),應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證,以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。流感病毒裂解疫苗含硫柳汞防腐劑,在無(wú)菌檢查過(guò)程中,該防腐劑的殘留有可能導(dǎo)致加入的驗(yàn)證菌株無(wú)法生長(zhǎng),從而導(dǎo)致無(wú)菌檢查法的驗(yàn)證失敗[6]。本研究用硫代硫酸鈉作為中和劑,該中和劑能夠成功的消除硫柳汞防腐劑的抑菌作用,從而建立了流感病毒裂解疫苗的無(wú)菌檢查法,現(xiàn)將筆者的研究總結(jié)報(bào)告如下。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器與設(shè)備 HTY無(wú)菌隔離器(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司);HTY-2000A集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司);一次性使用的全封閉三聯(lián)集菌培養(yǎng)器KDGB330(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司);生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

        1.2 樣品 本試驗(yàn)所用樣品為流感病毒裂解疫苗(批號(hào):20110604,規(guī)格:0.5ml/支),由北京天壇生物制品股份有限公司生產(chǎn)。

        1.3 試劑和培養(yǎng)基 0.1%蛋白胨水溶液、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基均按照中國(guó)藥典2010年版三部附錄[5]ⅫA無(wú)菌檢查法項(xiàng)下要求配制及滅菌。0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液:取硫代硫酸鈉26g與無(wú)水碳酸鈉0.20g,加新沸過(guò)的冷水適量使溶解,并稀釋至1000ml,搖勻,濾過(guò),分裝,滅菌,滅菌溫度為121℃,滅菌時(shí)間為30min。

        附表 流感病毒裂解疫苗無(wú)菌檢查法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

        1.4 菌種 本試驗(yàn)所用菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、大腸埃希菌(Escherichia coli) [CMCC(B)44 102]、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64 941]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003]購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

        2 方法

        2.1 菌液制備 按照中國(guó)藥典2010年三部附錄[5]ⅫA無(wú)菌檢查法項(xiàng)下對(duì)照菌液配置,菌液濃度10~100CFU/ml。

        2.2 試驗(yàn)方法 取樣品20支,全部轉(zhuǎn)移至稀釋液(0.1%蛋白胨水溶液或0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液)100ml中,作為供試液;取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(三聯(lián)),先用沖洗液(0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液)潤(rùn)濕濾膜,將上述供試液全部通過(guò)3個(gè)濾器,濾干后用沖洗液沖洗,沖洗1次,每次每膜100ml。過(guò)濾后,2個(gè)濾器加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各100ml,另1個(gè)濾器加改良馬丁培養(yǎng)基100ml。分別加入6種驗(yàn)證菌株(10~100CFU),硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的濾器置35℃培養(yǎng),改良馬丁培養(yǎng)基置25℃培養(yǎng),觀察驗(yàn)證菌生長(zhǎng)情況。

        3 結(jié)果與討論

        分別采用2種稀釋液的無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果見附表所示。采用0.1%蛋白胨水溶液作為稀釋液,4種細(xì)菌均生長(zhǎng)良好,而加入的白色念珠菌和黑曲霉未生長(zhǎng)。采用0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液作為稀釋液,4種細(xì)菌和2種真菌均生長(zhǎng)良好。細(xì)菌在使用兩種稀釋液的情況下均能夠生長(zhǎng)良好,分析原因可能是硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中含有硫乙醇酸鈉,該鈉鹽能夠中和汞類防腐劑硫柳汞[7]。而白色念珠菌和黑曲霉所用的培養(yǎng)基是改良馬丁培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基中沒(méi)有能夠中和汞類防腐劑的成分,因此,需要使用0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液作為中和劑,以便消除該疫苗樣品中的硫柳汞防腐劑的抑菌作用,從而使白色念珠菌和黑曲霉在培養(yǎng)72h后能夠生長(zhǎng)良好。

        4 結(jié)論

        流感裂解滅活疫苗是在全病毒顆粒疫苗的基礎(chǔ)上,采用適當(dāng)方法將流感病毒顆粒裂解,保留其有效抗原,去除易引起副反應(yīng)的成分。有研究表明,流感病毒表面的HA在流感病毒感染過(guò)程中起著重要作用,其抗體是一種保護(hù)性抗體;同時(shí)神經(jīng)氨酸酶抗體具有抑制流感病毒再感染的功能,所以也具有一定的保護(hù)作用;而病毒中的類脂成分和病毒顆粒內(nèi)部的蛋白不但對(duì)抗體產(chǎn)生顯著作用,還易引起接種副反應(yīng)。裂解劑的作用是裂解病毒核酸和大分子蛋白,保留其抗原的有效成分。但裂解劑濃度過(guò)高或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均會(huì)使血凝素(HA)發(fā)生斷裂,影響疫苗抗原性,因此裂解劑的選擇及作用條件非常重要。

        利用硫代硫酸鈉作為中和劑,能夠消除流感病毒裂解疫苗中所含的硫柳汞防腐劑的抑菌作用,建立該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查法為:取本品20支,全部轉(zhuǎn)移至0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液100ml中,經(jīng)薄膜過(guò)濾法處理,用0.1%蛋白胨水溶液分次沖洗(每膜不少于100ml),以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照菌,其余操作依照中國(guó)藥典2010年三部附錄[5]ⅫA無(wú)菌檢查法進(jìn)行,應(yīng)符合規(guī)定。

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