孫洪濤，孔凡芝，高津福

(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212002;2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052)

吸煙是導(dǎo)致牙周病的重要危險(xiǎn)因素之一。尼古丁是香煙煙霧中的主要成分，約占煙草生物堿總量的95%以上。有實(shí)驗(yàn)表明，尼古丁和煙草浸提液可抑制人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts，HGFs)的生長及貼附;HGFs可通過分泌大量的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的移動(dòng)、增殖、分化和產(chǎn)生基質(zhì)成分，在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮作用;細(xì)胞因子中的白介素－8(interleukin－8，IL－8)作為一種重要的炎性介質(zhì)，可直接或通過誘導(dǎo)其他因子參與牙槽骨吸收、膠原酶產(chǎn)生、趨化炎性細(xì)胞聚集等一系列可造成組織破壞的炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致牙周組織破壞，促進(jìn)牙周病的發(fā)展［1］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度尼古丁刺激對HGFs增殖、分泌IL－8的影響，探討尼古丁在牙周炎致病機(jī)制中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

高糖 DMEM培養(yǎng)基(GiBico，美國);胎牛血清、DMSO、MTT、ELISA試劑盒(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?;尼古丁(Wako，日本)。

1.2 方法

1.2.1 人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)培養(yǎng)

選擇因正畸治療需拔牙且牙齦健康的志愿者(知情同意)，并于拔牙時(shí)切取其少量牙齦組織;按組織塊培養(yǎng)法［2］，用含200 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、50 mL/L CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)HGFs。

1.2.2 不同濃度尼古丁對HGFs增殖活性影響的觀察

取生長良好的第4代HGFs，制成密度為1×104/mL的單細(xì)胞懸液，并以每孔200 μL接種于96孔板，置于37℃，50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞同步化后，吸棄培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，并將細(xì)胞隨機(jī)分為8組，分別加入含尼古丁濃度為 0 μg/mL(陰性對照組)、10、50、100、250、500、1000、2000 μg/mL 的含 FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)基(每孔200 μL)繼續(xù)培養(yǎng)。

分別于培養(yǎng)第24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)取各組細(xì)胞(每組5孔)，按MTT試劑盒說明進(jìn)行相應(yīng)處理后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔530 nm波長的OD值;并按以下公式計(jì)算各組細(xì)胞的生長抑制率:抑制率(%)=(未加尼古丁組OD值－加入尼古丁組OD值/未加尼古丁組OD值)×100%。

1.2.3 不同濃度尼古丁對HGFs分泌IL－8影響的觀察

取生長良好的第4代HGFs，制成密度為1×104/mL的單細(xì)胞懸液，并以每孔200 μL接種于96孔板，置于37℃，50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞同步化后，吸棄培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，并將細(xì)胞隨機(jī)分為8組，分別加入含尼古丁濃度為 0 μg/mL(陰性對照組)、10、50、100、250、500、1000 μg/mL 的含 FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)基(每孔200 μL)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清(每組5孔)，按試劑盒說明用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測培養(yǎng)上清中的IL－8含量。首先用酶標(biāo)儀測各孔540 nm波長的OD值，并以S/S0值(S=標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的OD值，S0=標(biāo)準(zhǔn)品0點(diǎn)OD值)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;然后根據(jù)樣本的吸光度值即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)IL－8的濃度值(pg/mL)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度尼古丁對HGFs增殖活性的影響

不同濃度(2000、1000、500、250、100、50、10 μg/mL)的尼古丁分別作用于 HGFs 24、48、72 h不同時(shí)間后，均能抑制HGFs的生長，各時(shí)間點(diǎn)各濃度尼古丁對HGFs生長的抑制率分別與正常對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而且各濃度尼古丁對HGFs生長的抑制率均隨培養(yǎng)時(shí)間而逐漸增加，即呈時(shí)間依賴性;各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，尼古丁對HGFs生長的抑制率均隨其濃度增加而逐漸增加，即呈濃度依賴性(表1)。

表1 不同濃度尼古丁作用HGFs 3 d后的OD值()

表1 不同濃度尼古丁作用HGFs 3 d后的OD值()

濃度(μg/mL) 作用時(shí)間(h)24 48 720 0.5510 ±0.0076 0.5334 ±0.0054 0.4244 ±0.005410 0.5270 ±0.0087 0.4830 ±0.0089 0.3736 ±0.004550 0.5178 ±0.0086 0.4552 ±0.0115 0.3572 ±0.0077100 0.5022 ±0.0038 0.4368 ±0.0079 0.3382 ±0.0053250 0.4876 ±0.0112 0.4120 ±0.0073 0.3178 ±0.0068500 0.4610 ±0.0080 0.3966 ±0.0111 0.3018 ±0.00891000 0.4316 ±0.0067 0.3514 ±0.0076 0.2352 ±0.00332000 0.4118 ±0.0090 0.3226 ±0.0179 0.2094 ±0.0086

2.2 不同濃度尼古丁對HGFs分泌IL－8的影響

ELISA 檢測顯示，HGFs 在 500、250、100、50、10 μg/mL尼古丁作用下，其合成IL－8的量均明顯高于正常對照組(P＜0.05)，其中100 μg/mL尼古丁組合成IL－8的量最高;1000 μg/mL尼古丁組對HGFs合成IL－8的影響不明顯，與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)(表2)。

表2 不同濃度尼古丁對HGFs合成IL－8影響的比較()

表2 不同濃度尼古丁對HGFs合成IL－8影響的比較()

* 與0 μg/mL 相比 P ＜0.05

尼古丁濃度(μg/mL) IL－8含量(pg/mL)052.58 ±3.8410 144.79 ±6.48*50 151.84 ±5.98*100 181.27 ±3.70*250 138.30 ±3.58*500 95.90 ±2.15*1000 58.06 ±3.58

3 討論

牙周病變時(shí)，由于牙齦上皮受損，細(xì)胞間隙增寬，外界的細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)可直接作用于牙周結(jié)締組織，影響其生長代謝和向牙根面的附著。牙齦成纖維細(xì)胞作為牙齦固有層的主要細(xì)胞，不僅具有活躍的自身更新能力，還可在細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)刺激下分泌多種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁作為香煙煙霧中的主要成分，不僅影響結(jié)締組織細(xì)胞如成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、附著和蛋白質(zhì)的合成、分泌，還影響成纖維細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)［3］。故本實(shí)驗(yàn)采用尼古丁作為刺激源刺激體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞，觀察其增殖及IL－8表達(dá)的變化，以期探討吸煙對牙周病發(fā)生發(fā)展影響的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在沒有尼古丁作用的情況下，HGFs表達(dá)IL－8的量較少;而在一定濃度范圍(10 ～500 μg/mL)尼古丁刺激下，HGFs分泌 IL－8的量明顯增多，其中以100 μg/mL時(shí)最高，此后逐漸降低。當(dāng)尼古丁濃度達(dá)到1000 μg/mL時(shí)，對HGFs合成IL－8的影響不明顯(與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。IL－8作為人體內(nèi)的一種細(xì)胞因子具有廣泛的生物學(xué)作用，可通過聚集和激活中性粒細(xì)胞而促進(jìn)牙周組織破壞。另外，IL－8作為一種重要的炎性細(xì)胞因子，不僅能促進(jìn)牙槽骨的吸收，同時(shí)還能抑制牙周膜的修復(fù)和代謝功能，并促進(jìn)其他炎癥介質(zhì)的釋放，從而影響牙周組織的改建、加重局部牙周組織的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙周病的發(fā)生、發(fā)展［4］。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，尼古丁可促進(jìn)口腔表皮樣癌細(xì)胞株分泌 IL－8［5］;IL－1、TNF 均能刺激牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL－8，IL－8除能激活人外周血中性粒細(xì)胞外，還可與IL－1、TNF及其他炎癥介質(zhì)協(xié)同發(fā)揮作用，從而介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在炎癥部位的聚集［6］。Iho等［7］發(fā)現(xiàn)，尼古丁作用于中性粒細(xì)胞后，可使其IL－8表達(dá)量增加，且在一定濃度范圍內(nèi)呈時(shí)間和濃度依賴性。Giannopoulou等［8］利用實(shí)驗(yàn)性牙齦炎模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者與非吸煙者相比，其齦溝液中的IL－8表達(dá)量明顯增加。Wendell等［9］發(fā)現(xiàn)，尼古丁可促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞分泌 IL－8。Bendre 等［10］報(bào)道，在牙周組織局部，IL－8除具有趨化中性粒細(xì)胞的作用外，還可間接刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生破骨細(xì)胞因子(RANKL)并刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，10～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)的尼古丁可促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞分泌IL－8，與上述結(jié)果基本一致;提示，尼古丁可通過刺激牙齦成纖維細(xì)胞導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。但本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)尼古丁濃度為1000 μg/mL時(shí)，對HGFs合成IL－8的影響不明顯，可能與尼古丁對細(xì)胞的毒性有關(guān)。因?yàn)樵谀峁哦舛冗^高的情況下，人牙齦成纖維細(xì)胞膜被破壞，使細(xì)胞蛋白成分減少，并影響細(xì)胞微管和波形蛋白細(xì)胞骨架，從而影響細(xì)胞分泌IL－8。

綜上所述，一定濃度范圍的尼古丁對體外人牙齦成纖維細(xì)胞的增殖及其分泌IL－8能力均有明顯的影響，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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