顧 炎，薛 健，常 琪，劉慧靈，劉新民

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

中藥材中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留問題受到社會各界的普遍重視，而人參作為重要的中藥材，其有機(jī)氯農(nóng)藥殘留更是備受關(guān)注。制定科學(xué)的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，對控制人參質(zhì)量十分必要。而生物有效性作為人類健康風(fēng)險評價中的關(guān)鍵因子，其重要性不言而喻。

目前，國際上的胃腸模擬法有十多種，其中比較成熟的有生理原理提取法 (PBET)［1］、荷蘭公共衛(wèi)生與環(huán)境國家研究院法 (RIVM)［2］、德國標(biāo)準(zhǔn)研究院法 (DIN)［3］以及人體腸道微生物生態(tài)模擬系統(tǒng)法 (SHIME)［4］等等。本實(shí)驗(yàn)采用《中國藥典》2010年版附錄［5］中的配方配制模擬人工胃腸液，對人參藥材中有機(jī)氯農(nóng)藥在消化道中的生物有效性進(jìn)行了初步的探究，旨在更好地評價人參中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留對人體的危害性，為其農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一些建議與參考。

1 儀器與試劑

Agilent(7890型)氣相色譜分析儀 (配備電子捕獲檢測器)、HP-5色譜柱 (30 m×0.32 mm×0.25 μm)(美國 Agilent公司)、DB-1701(30 m ×0.32 mm×0.25 μm)色譜柱 (美國Agilent公司)、PL203/01型電子天平 (瑞士梅特勒)、SK250HP型超聲波清洗器 (上?？茖?dǎo)儀器有限公司)、LABOROTA4000/4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (德國海道夫)、Feb-80型離心沉淀器 (金壇市醫(yī)療儀器廠)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (上海島韓實(shí)業(yè)有限公司)、SGK-5LB型低噪音空氣泵 (北京東方精華苑科技有限公司)。

分析純丙酮、石油醚、濃硫酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無水硫酸鈉 (北京化工廠);優(yōu)級純濃硫酸 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);1.2萬U/g胃蛋白酶、1.3萬U/g胰酶 (北京鴻潤寶順科技有限公司);100 mg/L的49種有機(jī)氯農(nóng)藥對照品(農(nóng)業(yè)部環(huán)保所)，配制成質(zhì)量濃度為0.05 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

本實(shí)驗(yàn)中所用的人參藥材是在眾多的測試樣品中選出的殘留農(nóng)藥種類較多 (8種)、殘留量較高的樣品，粉碎過篩。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參樣品中有機(jī)氯農(nóng)藥本底值測定［6-7］

2.1.1 樣品制備 稱取人參樣品2.0 g于100 mL具塞三角瓶中。加入丙酮-石油醚 (1∶1，V/V)30 mL超聲提取15 min，靜置，過濾。再用丙酮-石油醚 (1∶1)20 mL提取兩次，合并濾液，40℃水浴旋蒸濃縮至近干。將濃縮后的殘?jiān)D(zhuǎn)移至5 mL具塞刻度試管中，用石油醚定容至3 mL，小心加入1 mL濃硫酸，渦旋，離心，取上清液，加入2 mL水洗滌，離心，除去水層，有機(jī)層加入少量無水硫酸鈉干燥，離心，取上層清液，待測。

2.1.2 儀器分析 實(shí)驗(yàn)選用HP-5毛細(xì)管柱定量，DB-1701中等極性柱輔助定性。進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣。升溫程序:初始溫度120℃保持1 min，以8℃/min的速度升溫至150℃保持2 min，以4℃/min的速度升溫至205℃保持6 min，再以5℃/min的速度升溫至270℃，最后以1℃/min的速度升溫至280℃，保持5 min。ECD檢測器溫度:300℃。載氣體積流量1 mL/min。尾吹氣流60 mL/min。進(jìn)樣量1 μL。外標(biāo)法定量。

2.2 人工胃液環(huán)境中人參中有機(jī)氯農(nóng)藥的生物有效性測定

2.2.1 配制人工胃液［5］取稀鹽酸3.3 mL，加水約160 mL與胃蛋白酶2 g，搖勻后超聲15 min使得所有固體粉末溶解，加水稀釋成200 mL，即得。

2.2.2 胃模擬反應(yīng) 稱取2.0 g人參樣品于100 mL具塞錐形瓶中 (包錫紙避光)，加入50 mL人工胃液，蓋上瓶塞，在37℃恒溫震蕩培養(yǎng)搖床中以60 r/min振搖3 h后取出，冷卻，過濾。

2.2.3 樣品處理 將“2.2.2”項(xiàng)中所得濾液依次用100 mL、50 mL石油醚各萃取一次。合并萃取液，40℃旋蒸至近干，將濃縮后的殘?jiān)D(zhuǎn)移至5 mL具塞刻度試管中，用石油醚定容至3 mL，小心加入1 mL濃硫酸，渦旋，離心，取上清液，加入2 mL水洗滌，離心，除去水層，有機(jī)層加入少量無水硫酸鈉干燥，離心，取上層清液，待測。

2.2.4 儀器分析 分析條件同“2.1.2”項(xiàng)。

2.3 人工腸液環(huán)境中人參中有機(jī)氯農(nóng)藥的生物有效性測定

2.3.1 配制人工腸液 取1.36 g磷酸二氫鉀，加100 mL水溶解，用0.4%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8;另取胰酶2 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋成200 mL，即得。

2.3.2 腸模擬反應(yīng) 稱取2.0 g人參樣品于100 mL具塞錐形瓶中 (包錫紙避光)，加入50 mL人工腸液，蓋上瓶塞，在37℃恒溫震蕩培養(yǎng)搖床以60 r/min振搖5 h后取出，冷卻，過濾。

2.3.3 樣品處理 處理方法同“2.2.3”項(xiàng)。

2.3.4 儀器分析 分析條件同“2.1.2”項(xiàng)。

2.4 測定結(jié)果

2.4.1 圖1為HP-5柱條件下的對照品與人參本底值圖譜。

2.4.2 人參樣品中有機(jī)氯農(nóng)藥本底值及人工胃腸液中有機(jī)氯農(nóng)藥溶出量檢測，每份樣品制備3個平行，測定結(jié)果見表1。

2.4.3 通過人工胃腸液中有機(jī)氯農(nóng)藥溶出量與人參樣品總農(nóng)殘量的比值求得生物有效性值。結(jié)果詳見表2。

3 討論

圖1 HP-5柱條件下的對照品 (A)與人參本底值 (B)圖譜Fig.1 GC(HP-5)of the OCPs in Ginseng

表1 各樣品中有機(jī)氯農(nóng)藥測定結(jié)果 (n=3)Tab.1 Concentration of organochlorine pesticides in each sample(n=3)

表2 人參中的有機(jī)氯農(nóng)藥在人工胃腸液中生物有效性Tab.2 Bioavailability of organochlorine pesticides in Ginseng using the simulator of gastrointestinal tract

近年來，體外模擬法由于具有條件可控，穩(wěn)定性好，易于操作，可用于測試大批量樣品，同時還能避免活體實(shí)驗(yàn)所帶來的倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的被應(yīng)用于生物有效性的測定，在土壤中鉛、砷、鎘等無機(jī)物離子的生物有效性評估方面應(yīng)用廣泛且卓有成效［8］。但有機(jī)污染物的測定相對較少，尤其是食物基質(zhì)中的相關(guān)研究更為少見。這是因?yàn)橛袡C(jī)污染物在人體消化道中的轉(zhuǎn)化過程比較復(fù)雜，與有機(jī)質(zhì)含有量豐富的食物一同作為樣品測定難度較大。此外，目前不少測定的數(shù)據(jù)都是添加回收的方法獲得的［9-10］，不能準(zhǔn)確體現(xiàn)實(shí)際污染樣品生物有效性的情況。

本實(shí)驗(yàn)選取普查過程中獲得的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量較高的人參樣品，通過簡單的胃腸道消化條件模擬，測定了人參中殘留有機(jī)氯農(nóng)藥對人體的生物有效性，初步得到以下結(jié)果。

首先，從表2中可以看出，對8種檢測到的有機(jī)氯農(nóng)藥，在小腸環(huán)境中的生物有效性數(shù)值大多都高于胃環(huán)境。六氯苯和五氯硝基苯，在人工腸液中的生物有效性比在人工胃液中的大了接近一倍。個別農(nóng)藥，如β-六六六在兩種環(huán)境中，有效性數(shù)值相差較小。

其次，同一環(huán)境中，不同有機(jī)氯農(nóng)藥的生物有效性也存在著較大差異。在胃環(huán)境中，生物有效性值最大的是氟蟲脲 (19%)，生物有效性值最小的是β-六六六 (6.9%)，相差1倍多。而在腸環(huán)境中生物有效性最大的則是五氯苯 (25%)，β-六六六的生物有效性值最小 (6.1%)，兩者相差接近3倍。由于本實(shí)驗(yàn)使用的是自然殘留的人參樣品，不同種類的農(nóng)藥殘留相差較大，濃度差異是否對結(jié)果造成影響，還有待于進(jìn)一步的研究。

最后，在本實(shí)驗(yàn)中，無論是腸環(huán)境還是胃環(huán)境中，有機(jī)氯農(nóng)藥對人體的生物有效性都小于30%，最小的只有不到10%，這意味著隨著人參進(jìn)入人體的那部分農(nóng)藥，實(shí)際上最終能進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的只占了總量的一部分。由此可以給相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定一些提示:生物有效性的數(shù)據(jù)，對制定科學(xué)的限量標(biāo)準(zhǔn)具有一定意義。

本實(shí)驗(yàn)中所使用的胃腸模擬配方是最簡單的一種，僅考慮了模擬液的pH和酶兩個因素，沒有考慮胃腸液中的有機(jī)物、無機(jī)鹽以及微生物等因素所帶來的影響，今后還應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步模擬胃腸條件進(jìn)行相關(guān)研究，并比較不同條件下得出的結(jié)果的差異性。另外，體外模擬的實(shí)驗(yàn)，最終都需要活體實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證才能確認(rèn)其正確性，因此，進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行確證也是以后需要著重考慮的方向。

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