朱 倩，付文煥，李近磊，張惠清，李中東

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040)

復(fù)方芙蓉葉糊 (曾用名:三圣散)為復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院特色外用制劑，由芙蓉葉、赤小豆組方而成，功能主治解毒排膿，用于消炎消腫［1-2］。臨床應(yīng)用30余年，效果良好。該制劑主要原料為中藥材原粉，且輔料為麥芽糖，制備成糊劑后很難再對其進行常規(guī)滅菌，細菌數(shù)、霉菌酵母菌數(shù)均難以控制，成品制劑的微生物限度檢驗結(jié)果很難達到《中國藥典》2010年版要求。因此考慮在制劑制備前，對原料中的中藥原粉進行滅菌處理后再制成制劑，嚴格控制制劑制備環(huán)境，以使成品制劑達到微生物限度要求。芙蓉葉粉為本制劑主要原料，且為制劑的主要藥用成分。本實驗通過對芙蓉葉粉進行熱壓滅菌、60鈷輻射滅菌和低溫間歇滅菌，考察原料滅菌后的性狀、主要成分含有量及滅菌效果，確定該原料的最佳滅菌工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Dikama C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);Sartorius BL150 電子天平，YXQ-LS-50S II型立式壓力蒸汽滅菌器;DHG-9426電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，60鈷射線源由中國科學(xué)院上海輻照中心提供。

1.2 試藥 芙蓉葉粉 (上海市虹橋飲片廠);蘆丁對照品(批號100080-200707，中國藥品生物制品檢定所);槲皮素對照品 (批號100081-200406，中國食品藥品檢定研究院)。

1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (批號20101218)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 (批號20101121)、蛋白胨水培養(yǎng)基 (批號20101130)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基 (批號20101207)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 (批號20101211)、甘露醇氯化鈉瓊脂平板(20101208)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板 (批號20101208)，均購自上海盛思生化科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 滅菌方法

2.1.1 熱壓滅菌法［3］將20 g芙蓉葉粉稱入干燥滅菌試管中，密封。置壓力蒸汽滅菌器中，121℃下，滅菌30 min。

2.1.260鈷輻射滅菌法［4-5］將20 g芙蓉葉粉稱入干燥滅菌試管中，密封。在中國科學(xué)院上海輻照中心進行60鈷輻射滅菌，輻照強度6 kGy。

2.1.3 低溫間歇滅菌法［6-7］將5 g芙蓉葉粉稱入直徑90 mm有蓋滅菌培養(yǎng)皿中，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，60℃恒溫1 h后，于25℃保持24 h，記為滅菌1次;同法在60℃下分別滅菌2次、3次和4次。依上述方法同法操作，于70℃與80℃下分別各滅菌2次、3次、4次。

2.2 微生物限度檢查［8-9］對原粉及上述3種方法滅菌后的樣品，按《中國藥典》微生物限度檢查法，進行微生物限度檢查。按芙蓉葉原料占原制劑處方百分比16%，換算細菌數(shù)與霉菌數(shù)。滅菌前后原料性狀及微生物限度檢查結(jié)果見表1。

表1 芙蓉葉粉不同滅菌方法微生物限度檢查結(jié)果 (n=3)

2.3 定量測定［10-12］

2.3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品適量，用60%乙醇溶解后配制成含蘆丁105.6 μg/mL、槲皮素105.4 μg/mL的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取芙蓉葉粉末 (過80目篩)2 g，于100 mL錐形瓶中，加入60 mL 60%乙醇溶液，稱定質(zhì)量，超聲提取3 h，冷卻后用60%乙醇溶液補足質(zhì)量。經(jīng)0.45 μm的濾膜濾過，取續(xù)濾液供 HPLC測定用。

2.3.3 色譜條件 Dikama C18色譜柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液洗脫 (45∶55)，體積流量1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長350 nm。在該色譜條件下，蘆丁、槲皮素分離良好。色譜圖見圖1～2。

圖1 蘆丁、槲皮素對照品HPLC圖譜

圖2 芙蓉葉粉供試品HPLC色譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品溶液2、5、10、15、20 μL。依照上述色譜條件測定蘆丁及槲皮素峰面積，以峰面積為Y，進樣量為X，進行線性回歸分析，得蘆丁、槲皮素的回歸方程分別為:Y蘆丁=1468327X+24468，r=0.9994;Y槲皮素=2992329X － 123978，r=0.9993。結(jié)果表明，蘆丁、槲皮素分別在0.2112～2.112 μg、0.2108～2.108 μg間呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗 對同一份芙蓉葉樣品平行測定5次，蘆丁、槲皮素的RSD分別為2.3%、3.5%(n=5)。

2.3.6 重復(fù)性試驗 精密稱同一份芙蓉葉樣品5份，按上述方法制備供試品溶液，參照上述色譜條件，分別測定蘆丁、槲皮素的重復(fù)性RSD分別為4.26%、3.66%(n=5)。

2.3.7 回收率試驗 精密稱取已知含有量的芙蓉葉藥材粉末9份，每份2 g，按樣品含蘆丁、槲皮素的50%精密加入蘆丁、槲皮素對照品溶液，按相同方法制備供試品溶液，進樣量10 μL。結(jié)果蘆丁、槲皮素的回收率分別為97% ～104%，93%～98%;精密度 (RSD)分別為1.7%～2.0%、1.5% ～2.7%(n=3)。

2.3.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h測定蘆丁、槲皮素，其RSD分別為2.1%、4.2%(n=5)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 樣品的測定 分別取不同滅菌工藝處理后的芙蓉葉藥材粉末，參照上述方法制備供試品溶液、按相同的色譜條件進行含量測定。結(jié)果見表2。

表2 不同滅菌方法對芙蓉葉粉中蘆丁及槲皮素的影響 (n=3)

3 討論

3.1 微生物檢查及定量測定結(jié)果顯示，經(jīng)過3種方法滅菌后，芙蓉葉藥材能夠符合藥典微生物限度標準的為熱壓滅菌法、60鈷輻射滅菌法及低溫間歇滅菌法80℃下4次滅菌。對這3種滅菌后的芙蓉葉粉中蘆丁槲皮素進行測定，表2結(jié)果顯示，芙蓉葉主要的黃酮類成分在低溫間歇滅菌法前后差異不大;熱壓滅菌法及60鈷輻射滅菌法對芙蓉葉中蘆丁及槲皮素的含有量有影響。

3.2 本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熱壓滅菌后，芙蓉葉粉的性狀有明顯改變，粉末顏色發(fā)生變化，且有結(jié)塊現(xiàn)象，并且在放置冷卻過程中粉末容易吸潮不利于下一步的制劑生產(chǎn)，故該藥材粉末不適用于熱壓滅菌法。

3.3 上述試驗結(jié)果表明，通過60鈷輻射滅菌，芙蓉葉粉中主要成分含有量發(fā)生變化。使用經(jīng)60鈷輻射滅菌的芙蓉葉粉制備芙蓉葉糊劑的過程中，在原處方比例條件下難以成形。輻照滅菌技術(shù)與傳統(tǒng)的蒸汽壓力消毒滅菌、化學(xué)及過濾滅菌法相比，輻照滅菌法可在常溫下消毒滅菌而不破壞易揮發(fā)成分及熱敏性物質(zhì)，穿透力強，消毒均勻快速，操作簡單等優(yōu)點，但是對芙蓉葉進行輻照滅菌，會破壞其成分［13-14］。這提示我們在選擇輻射滅菌法對中藥材進行處理時需要注意進行充分考察驗證。

綜上所述，低溫間歇滅菌法可作為芙蓉葉粉控制微生物限度的滅菌方法。該方法操作不需要特殊設(shè)備，操作簡便、安全、快捷，藥品質(zhì)量穩(wěn)定，成本低，可用于復(fù)方芙蓉葉糊中芙蓉葉粉藥材的滅菌。同時本研究為一些不耐高溫高壓、濕熱的中藥原料滅菌提供了參考。

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