孫 宇，卿德剛，張 娟，倪 慧，賈曉光

(新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆烏魯木齊 830002)

白花丹Plumbago zeylanica L.系白花丹科植物，為維吾爾醫(yī)常用藥，維語(yǔ)名稱為夏特然吉印地，藥用部位為干燥莖枝［1］。白花丹具有消除異常體液，開(kāi)通濕寒氣阻，清音利咽止痛，消食助陽(yáng)療膚等功效。在維吾爾醫(yī)藥中常用于皮膚白斑，白癜風(fēng)，癱瘓，面癱及關(guān)節(jié)疼痛等病的治療［2-4］。近些年來(lái)制劑產(chǎn)品快速發(fā)展，新疆地區(qū)白花丹藥材需求量逐年增加。由于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀鑒別、顯微鑒別和性質(zhì)、功能主治等內(nèi)容，致使目前藥材市場(chǎng)上藥材來(lái)源混亂，質(zhì)量參差不齊。為了進(jìn)一步提高白花丹藥材的質(zhì)量控制水平，本實(shí)驗(yàn)首先確定了維藥中使用的白花丹藥材基源，后對(duì)不同產(chǎn)地藥材的性狀鑒別、顯微鑒別［5-6］、薄層鑒別［7-9］及水分、灰分、浸出物［10］及白花丹醌的量［11-13］等項(xiàng)目進(jìn)行研究，為維藥白花丹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2010CHT型高效液相色譜儀;Mettler AE163電子天平;徠卡RM2245旋轉(zhuǎn)切片機(jī);Olympus BX51光學(xué)顯微鏡。

1.2 試藥 白花丹醌對(duì)照品 (批號(hào)P7262)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。液相用甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。白花丹藥材采購(gòu)自新疆烏魯木齊、和田、喀什及廣西恭城、南寧等地，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所主任藥師劉勇民鑒定均為白花丹科植物白花丹Plumbago zeylanica L.不帶葉干燥莖枝。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材性狀鑒別 本品藥用部位為白花丹的干燥莖枝，莖呈長(zhǎng)圓柱形，長(zhǎng)短不一，有時(shí)可見(jiàn)明顯的節(jié)，具細(xì)縱棱，直徑2～8 mm，表面綠色、黃綠色至淡棕褐色。質(zhì)輕，易折斷，斷面皮部纖維狀，內(nèi)層顆粒狀，髓部類白色，海綿狀，松軟;氣微，味淡。

2.2 顯微鑒別

2.2.1 白花丹莖橫切面顯微特征 表皮細(xì)胞1列，橢圓形，切線延長(zhǎng);外被角質(zhì)層。皮內(nèi)側(cè)有2～3列厚壁細(xì)胞，棱脊處多達(dá)6～8列;皮層為2～8列薄壁細(xì)胞，散有分泌細(xì)胞，內(nèi)含棕黃色團(tuán)塊;中柱鞘纖維3～6列，排列成波狀環(huán)形，棱脊處較多;維管束外韌性，導(dǎo)管單個(gè)或數(shù)個(gè)成群，徑向排列，形成層不明顯，髓部薄壁細(xì)胞呈長(zhǎng)圓形，可見(jiàn)紋孔，老枝木部較寬。見(jiàn)圖1。

圖1 白花丹顯微鑒別莖橫截面切片圖Fig.1 Microscopic identification of Plumbago zeylanica L.stem cross-sectional slices

2.2.2 白花丹藥材粉末特征 粉末呈淡黃綠色至淡棕黃色。氣孔環(huán)式，副衛(wèi)細(xì)胞多3個(gè)，大小近相等。惡腺 (硅質(zhì)細(xì)胞)近圓形，直徑35～40微米;表面具“十”字交叉及類方形紋理;導(dǎo)管網(wǎng)紋、具緣紋孔或環(huán)紋，直徑10～45微米;髓細(xì)胞類長(zhǎng)方形，長(zhǎng)70～140微米，寬40～70微米，表面具圓形壁孔，纖維長(zhǎng)梭形，直徑10～30微米，壁孔明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 白花丹顯微鑒別粉末拼圖Fig.2 Microscopic identification of Plumbago zeylanica L.powder jigsaw

2.3 薄層色譜鑒別 取本品粉末5 g，加甲醇50 mL，超聲提取30 min，放冷，濾過(guò)，取濾液加入50 mL水，混勻后，用三氯甲烷振搖提取2次，每次50 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取白花丹醌對(duì)照品，用甲醇配制成0.1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液15 μL，對(duì)照品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸 (7.5∶1∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。置氨水蒸氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在于對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

圖3 白花丹藥材薄層色譜圖Fig.3 TLC chromatograms of Plumbago herbs

2.4 水分、總灰分和醇溶性浸出物測(cè)定 水分測(cè)定、灰分測(cè)定、醇溶性浸出物測(cè)定分別按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅨH(烘干法)、附錄ⅨK、附錄ⅩA(醇溶性浸出物測(cè)定法)等項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果含水量為5.8% ～8.3%，總灰分含有量2.97%～8.75%，醇溶性浸出物含有量為9.92% ～17.46%。

2.5 樣品中白花丹醌測(cè)定

2.5.1 色譜條件 島津 LC solution工作站;Waters XTerra RPC18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水 (60∶40)為流動(dòng)相;紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品及樣品的HPLC圖見(jiàn)圖4。

圖4 白花丹藥材及白花丹醌對(duì)照品色譜圖Fig.4 HPLC chromatogramsofPlumbagoherbs and plumbagin

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取白花丹醌對(duì)照品1.74 mg，加25 mL甲醇溶解制成每1 mL含69.6 μg的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取白花丹藥材粉末(過(guò)二號(hào)篩)約 1.5 g(廣西南寧產(chǎn)，批號(hào)20120310)，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL甲醇，精密稱定，超聲提取30 min，取出，待冷卻后，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm濾膜，作為供試品溶液。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μL，在色譜條件下，依次進(jìn)樣，以對(duì)照品進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，Y=414893X －103703，r=0.9998。結(jié)果表明白花丹醌在0.0286～0.4576 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算，RSD為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品6份，按“2.5.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定白花丹醌的峰面積，計(jì)算，結(jié)果RSD為1.3%。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定白花丹醌峰面積的RSD值為0.82%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的樣品(廣西南寧產(chǎn)，批號(hào)20120310)1.5 g共6份，精密稱定，分別加入相同量的質(zhì)量濃度為69.6 μg/mL的對(duì)照品溶液。按“2.5.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.5.9 樣品測(cè)定 取12批白花丹樣品，精密稱定，分別按“2.5.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 結(jié)論與討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)對(duì)收集到的白花丹藥材進(jìn)行了性狀鑒別及顯微鑒別實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)藥材性狀特征基本一致;藥材莖橫截面顯微圖譜中發(fā)現(xiàn)皮層細(xì)胞中常含有棕黃色分泌細(xì)胞;藥材粉末鑒別中發(fā)現(xiàn)呈“十”字交叉及類方形紋理，近圓形的惡腺 (硅質(zhì)細(xì)胞)，以上特征穩(wěn)定，可作為維藥白花丹藥材顯微鑒別的主要特征。

表2 12批白花丹藥材來(lái)源及測(cè)定結(jié)果Tab.2 Medicinal sources of 12 batches of Plumbago herbs and measurement results

3.2 分別考察了三氯甲烷-甲醇、石油醚-丙酮、石油醚-乙酸乙酯等不同薄層展開(kāi)體系;分別對(duì)10批樣品進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸 (7.5∶1∶0.5)作為展開(kāi)劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分離度好，斑點(diǎn)相對(duì)位置和重復(fù)性好。比較了國(guó)家藥典規(guī)定使用的5種硅膠板，結(jié)果表明均可對(duì)白花丹中的白花丹醌進(jìn)行定性鑒別。

3.3 采用國(guó)家藥典附錄方法，對(duì)藥材的水分、灰分、浸出物及有效成分的量進(jìn)行了檢查，根據(jù)所測(cè)結(jié)果，擬定:白花丹藥材 (主要是新疆地區(qū))水分不得過(guò)9.0%;總灰分不得過(guò)9.0%;醇溶性浸出物不得少于10.0%。

3.4 對(duì)提取溶劑 (甲醇、乙醇、三氯甲烷等)、提取方法 (冷浸、超聲、回流提取)、提取時(shí)間、提取溶劑進(jìn)行考察，最終建立了白花丹藥材中白花丹醌的HPLC定量測(cè)定的方法，對(duì)12批白花丹藥材進(jìn)行了定性定量分析，結(jié)果表明各樣品均可檢出白花丹醌，其在不同產(chǎn)地的樣品中含有量差異較大，有必要進(jìn)行質(zhì)量控制。

本研究建立的維藥白花丹的定性、定量檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可為維吾爾藥白花丹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升、促進(jìn)其深層次的開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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