徐小飛，潘雪峰，張慧曄，鄧喬華，黃亦南，王德勤

(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東廣州 510515)

(Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Company Limited，Guangzhou 510515，China)

中藥成分較為復(fù)雜，逐步建立采用多指標(biāo)成分綜合評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的新模式，更能表征中藥化學(xué)成分的整體性和復(fù)雜性，從而有效地評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量［1-4］。在中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)過(guò)程中，一測(cè)多評(píng)［5］(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)法由于易于實(shí)現(xiàn)多成分的同步測(cè)定，在中藥大品種的原料、成品生產(chǎn)和檢驗(yàn)中備受企業(yè)的青睞，其顯著的優(yōu)勢(shì)在于采用相對(duì)校正因子，能夠在僅使用一個(gè)對(duì)照品的情況下，實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)成分測(cè)定，成為一種適合中藥特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)新模式。并已成功運(yùn)用于人參、三七、關(guān)黃柏等藥材中多種成分的定量測(cè)定［6-8］。

板藍(lán)根Isatidis Radix來(lái)源于十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根。具有清熱、解毒、涼血、利咽之功效，是清熱解毒類中藥的代表藥物。 《中國(guó)藥典》2010年版中板藍(lán)根僅僅使用(R，S)-告依春?jiǎn)我粰z測(cè)指標(biāo)［9］，不能全面反映板藍(lán)根藥材的質(zhì)量。現(xiàn)代藥理研究表明板藍(lán)根中核苷類成分具有抗毒、解熱和活血等作用［10-12］。所以，本實(shí)驗(yàn)以相對(duì)較穩(wěn)定且對(duì)照品易得的腺苷、胞苷和尿苷為對(duì)照，考察建立“一測(cè)多評(píng)”分析方法測(cè)定板藍(lán)根中主要活性成分胞苷、腺苷、尿苷、鳥苷和 (R，S)-告依春的量的可行性，為板藍(lán)根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及“一測(cè)多評(píng)”法在中藥質(zhì)控中的推廣應(yīng)用提供了更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent公司)、Agilent 1100高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent公司)和Waters 2695-2996高效液相色譜儀 (美國(guó)Waters公司)。CP225D十萬(wàn)分之一電子天平 (Sartorius公司)、BT214D萬(wàn)分之一電子天平 (Sartorius公司)、SB25-12DTD超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)及錐形瓶、漏斗、濾紙等。

1.2 試劑 甲醇 (色譜純，美國(guó)Tedia公司)，水為高純水，其余試劑均為分析純。

1.3 對(duì)照品及樣品 腺苷 (批號(hào)110879-201202)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，鳥苷 (批號(hào)106K1848)、尿苷 (批號(hào) 1001157075)、胞苷(批號(hào)100914316)對(duì)照品購(gòu)自德國(guó)SIGMA公司，(R，S)-告依春 (批號(hào)111753-201103)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。實(shí)驗(yàn)用33批板藍(lán)根藥材收集于黑龍江大慶、安徽、河南、河北、陜西、山西、山東日照和甘肅，經(jīng)廣東省中藥研究所丘金裕教授鑒定，原植物為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為水-甲醇，梯度洗脫(0～20 min，5% ～5%甲醇;20～30 min，5% ～15%甲醇;30～45 min，15% ～15%甲醇)。體積流量0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。色譜峰記錄時(shí)間為45 min，隨后繼續(xù)運(yùn)行20 min。上述色譜條件下，各待測(cè)組分峰分離效果良好 (分離度＞1.5)，見(jiàn)圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷、(R，S)-告依春各對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加水制成每1 mL含胞苷0.0212 mg、尿苷0.0382 mg、鳥苷 0.0380 mg、腺苷0.0282 mg、(R，S)-告依春0.2881 mg的混合溶液，搖勻，即得。

圖1 對(duì)照品和板藍(lán)根樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and sample of Isatidis Radix

2.1.3 供試品溶液的制備 取板藍(lán)根粉末 (過(guò)四號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱定質(zhì)量，搖勻，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL，以混合對(duì)照品溶液中各成分進(jìn)樣體積與峰面積積分值進(jìn)行線性回歸處理，得到胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和(R，S)-告依春的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明5種成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)下表1。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear regression equations of each component

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和 (R，S)-告依春的RSD分別為0.1%、0.2%、0.2%、0.2%、0.8%。表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 取新制備的板藍(lán)根供試品溶液，在室溫下放置 0、2、4、8、10、12 h后各精密吸取10 μL進(jìn)樣，胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和(R，S)-告依春色譜峰峰面積的RSD分別為2.0%、1.1%、1.1%、0.5%和1.2%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性考察 取同一批板藍(lán)根藥材粉末 (大慶23)，共6份，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)方法制備樣品，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分的量，計(jì)算得出胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和(R，S)-告依春的RSD分別為2.2%、1.2%、2.8%、0.7%、2.5%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率 精密稱取已知含有量的同一批次樣品6份，加入各成分對(duì)照品適量，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試液，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣10 μL，按照外標(biāo)法計(jì)算各成分的量，并計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率考察結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recorery tests(n=6)

2.2 相對(duì)校正因子的計(jì)算及其耐用性驗(yàn)證

2.2.1 待測(cè)成分相對(duì)校正因子的計(jì)算 在一定的范圍內(nèi) (線性范圍內(nèi))待測(cè)成分的量 (W)與檢測(cè)器響應(yīng)值 (A)成正比，即W=fA，選取待測(cè)成分中一組分k為內(nèi)標(biāo)，建立組分k與其他組分m之間的相對(duì)校正因子，即 fkm=fk/fm= (Wk×Am)/(Wm×Ak)。配置一定質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，精密吸取不同體積的同一混合對(duì)照品進(jìn)樣分析，分別計(jì)算不同進(jìn)樣體積下的fkm，然后計(jì)算平均值，并以其作為相對(duì)校正因子進(jìn)行樣品測(cè)定，見(jiàn)下表3。

表3 待測(cè)成分相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果 (以腺苷為參照成分)Tab.3 Results of relative correction factors of components under test(adenosine as reference)

2.2.2 采用不同高效液相色譜儀測(cè)定的耐用性驗(yàn)證 取“2.1.2”項(xiàng)下的系列混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL，采用Agilent C18色譜柱，分別在Agilent 1260、Agilent 1100、Waters2695-2996高效液相色譜儀上進(jìn)樣檢測(cè)，求算以胞苷、尿苷及腺苷分別作為參照成分時(shí)其他4種成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果說(shuō)明相對(duì)校正因子在使用不同儀器時(shí)的耐用性良好，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.3 采用不同C18色譜柱測(cè)定的耐用性驗(yàn)證 取“2.1.2”項(xiàng)下的系列混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL，在Agilent 1260高效液相色譜儀上，分別采用Agilent C18色譜柱、Dikma Diamonsil C18色譜柱和Hibar RP-18色譜柱進(jìn)行檢測(cè)，求算以胞苷、尿苷及腺苷分別作為參照成分時(shí)其他4種成分的相對(duì)校正因子，使用不同色譜柱測(cè)定時(shí)各相對(duì)校正因子RSD＜1.25%，說(shuō)明相對(duì)校正因子在使用不同色譜柱時(shí)耐用性良好，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.3 待測(cè)成分色譜峰的定位 本研究比較了在使用不同儀器及色譜柱進(jìn)行測(cè)定時(shí)，保留時(shí)間、保留時(shí)間差值 (絕對(duì)值)及相對(duì)保留時(shí)間對(duì)5種待測(cè)成分色譜峰在色譜圖上的定位準(zhǔn)確度 (以RSD值評(píng)價(jià))。各待測(cè)成分的保留時(shí)間、保留時(shí)間差值及相對(duì)保留值的RSD值分別為0.21%～1.23%;0.62% ～2.41%;0.20% ～1.27%。由結(jié)果可知，保留時(shí)間差值的變化范圍稍大，保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間數(shù)值穩(wěn)定，可以用于待測(cè)成分色譜峰的定位，結(jié)果見(jiàn)表6、7。

表4 不同液相色譜儀測(cè)定的相對(duì)校正因子耐用性考察結(jié)果Tab.4 Relative correction factors determined with different HPLC instruments

表5 不同C18色譜柱測(cè)定的相對(duì)校正因子耐用性考察結(jié)果Tab.5 Relative correction factors determined on different HPLC columns

表6 板藍(lán)根各成分保留時(shí)間結(jié)果Tab.6 Resulets of the retention time

表7 板藍(lán)根各成分保留時(shí)間差值絕對(duì)值和相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果Tab.7 Results of differences in retention time and relative retention values

2.4 “一測(cè)多評(píng)”法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較以腺苷為代表作為“一測(cè)多評(píng)”的參照成分，計(jì)算33批板藍(lán)根藥材樣品中5種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Wf)，并與外標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果 (Ws)進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表8，由表8可見(jiàn)同一成分分別用2種方法求得的含有量值之間均無(wú)顯著性差異。此外，采用外標(biāo)法與“一測(cè)多評(píng)”法所得數(shù)據(jù)的比值 (Ws/Wf)評(píng)價(jià)“一測(cè)多評(píng)”法的準(zhǔn)確度，以腺苷作為參照成分時(shí)，各成分 (Ws/Wf)的比值在97.48%～104.66%之間。結(jié)果表明建立的“一測(cè)多評(píng)”法的準(zhǔn)確度與外標(biāo)法相當(dāng)，見(jiàn)表9。

表8 兩種方法測(cè)定33批板藍(lán)根藥材中5種成分的結(jié)果Tab.8 Contents of five kinds of Isatidis Radix by QAMS method and standards calibration method

表9 外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定5種成分的準(zhǔn)確度比較()Tab.9 Comparision of QAMS method and standards calibration method()

表9 外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定5種成分的準(zhǔn)確度比較()Tab.9 Comparision of QAMS method and standards calibration method()

注:準(zhǔn)確度=(Ws/Wf)×100%;Ws為外標(biāo)法;Wf為一測(cè)多評(píng)法。表中數(shù)據(jù)為33批板藍(lán)根藥材的x ± s。

成分 RSD/%胞苷101.57±1.01 0.99101.07±3.59 3.55尿苷 100.23±0.76 0.76鳥苷 100.98±0.74 0.73(R，S)-告依春 99.65 ±0.79 0.79總量

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)建立了板藍(lán)根中5種有效成分同時(shí)測(cè)定的“一測(cè)多評(píng)”方法;在本實(shí)驗(yàn)中所采用的液相色譜條件可同時(shí)檢測(cè)到板藍(lán)根中的胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷、腺嘌呤和(R，S)-告依春6種成分，實(shí)驗(yàn)以外標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，以外標(biāo)法 (Ws)與“一測(cè)多評(píng)”法 (Wf)分別測(cè)得的量的比值(Ws/Wf)評(píng)價(jià)“一測(cè)多評(píng)”法計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明除了腺嘌呤外，其他4種核苷及(R，S)-告依春的量與外標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。

3.2 板藍(lán)根中的核苷類成分對(duì)照品較難得到，只有腺苷購(gòu)自國(guó)家認(rèn)可的對(duì)照品檢定所，另外通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，鳥苷、 (R，S)-告依春穩(wěn)定性較差。綜合以上兩點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)選擇了對(duì)照品易得且較穩(wěn)定的腺苷、尿苷和胞苷為參照成分計(jì)算校正因子，論文中僅以腺苷為代表進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同儀器、不同品牌的C18色譜柱及不同波長(zhǎng)的相對(duì)校正因子的變化進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示不同儀器和不同C18色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響較小，RSD值均＜3%，說(shuō)明本方法對(duì)于不同儀器和C18色譜柱具有良好的適用性;而在249～259 nm的5個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下RSD值較大，說(shuō)明本方法得到的相對(duì)校正因子受檢測(cè)波長(zhǎng)變化影響較大，因此，在運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)建立的“一測(cè)多評(píng)”法測(cè)定時(shí)波長(zhǎng)為254 nm，不宜較大波動(dòng)。

3.4 本實(shí)驗(yàn)分別采用保留時(shí)間、保留時(shí)間差值(絕對(duì)值)和相對(duì)保留時(shí)間對(duì)待測(cè)成分色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果顯示除保留時(shí)間差值定位準(zhǔn)確度稍差外，保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間都可以對(duì)待測(cè)組分峰準(zhǔn)確定位。所以在缺乏對(duì)照品時(shí)，采用本實(shí)驗(yàn)提供的相對(duì)校正因子及定位方法，選用另外1種成分作為參照時(shí)也可得到較好的定位、定量效果。

3.5 由于對(duì)照品純度問(wèn)題，C18色譜柱填料的性能，不同牌號(hào)色譜柱可能有微小差別 (鍵合相的復(fù)蓋度、碳含量等)等等均可能帶來(lái)較大的誤差，所以此方法也存在一定的局限性。

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