肖明明， 侯 慧， 任秋華， 高 爽， 景士兵， 杜振廣

實(shí)驗(yàn)研究

HER2在病理性瘢痕組織中的蛋白表達(dá)、基因擴(kuò)增及其臨床意義

肖明明， 侯 慧， 任秋華， 高 爽， 景士兵， 杜振廣

目的探討人類表皮生長因子受體2(HER2)在正常皮膚組織、成熟性瘢痕及病理性瘢痕中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫熒光原位雜交和組織芯片免疫組化學(xué)鏈菌素親生物素-過氧化酶連接法，檢測正常皮膚10例、成熟瘢痕16例、增生性瘢痕9例和瘢痕疙瘩40例中HER2蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增情況。結(jié)果正常皮膚、成熟瘢痕、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中，HER2蛋白陽性表達(dá)率分別為0、25.00%、66.67%、85.00%；基因擴(kuò)增陽性率分別為0、12.50%、55.56%、80.00%。病理性瘢痕中HER2蛋白表達(dá)水平、基因擴(kuò)增陽性率均較高，與正常皮膚、成熟性瘢痕比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論HER2在病理性瘢痕中表達(dá)增強(qiáng)，提示HER2可能參與了病理性瘢痕的形成，故針對HER2靶向治療瘢痕，有一定的臨床應(yīng)用前景。

人類表皮生長因子受體2； 瘢痕； 免疫熒光； 免疫組織化學(xué)

人體皮膚創(chuàng)傷后發(fā)生瘢痕修復(fù)，當(dāng)瘢痕形成超過正常限度時，稱為病理性瘢痕。臨床最常見的病理性瘢痕包括增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)和瘢痕疙瘩(keloid)[1]。病理性瘢痕不僅嚴(yán)重影響美觀，而且后期易發(fā)生攣縮，導(dǎo)致組織或器官移位變形，因此，預(yù)防及治療病理性瘢痕的臨床意義重大[2]。筆者采用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridization,FISH)和組織芯片免疫組化鏈菌素親生物素-過氧化酶連接法(streptavidin peroxidase conjugated method,SP)在基因及蛋白水平檢測正常皮膚、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER2)蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增情況，探討其與病理性瘢痕形成的關(guān)系，以期為病理性瘢痕的臨床治療提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)本取自2005年1月至2013年6月在遼寧省人民醫(yī)院手術(shù)切除存檔的石蠟包埋組織，共75例。其中瘢痕疙瘩40例，增生性瘢痕9例，正常皮膚10例(取自病理性瘢痕周圍的正常皮膚或植皮患者取皮區(qū)正常皮膚)，成熟瘢痕16例(在手術(shù)或外傷1年后，瘢痕色澤變淡，外形平整，光鏡下膠原纖維平行排列)。所有患者術(shù)前均未做化學(xué)治療及放射治療，1年內(nèi)無注射藥物及外用藥物史。將蠟塊切5 μm切片1張，經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining, HE)染色后，在蠟塊上選取相應(yīng)區(qū)域，采用手工組織芯片制備儀(上海博南生物技術(shù)有限公司)，制備組織標(biāo)本直徑為2 mm的組織芯片，從芯片蠟塊上切5 μm切片3張，分別用于HE染色、FISH及SP法分析。

1.2 主要試劑和方法

1.2.1 組織芯片蠟塊制備 將受體蠟塊放在37 ℃恒溫臺上，軟化5 min；固定蠟塊，利用2 mm點(diǎn)樣針，在受體蠟塊上打孔，針點(diǎn)間隔1 mm，受體蠟塊按10×6陣列打孔；打孔完成后，使用點(diǎn)樣針在預(yù)先做好取樣標(biāo)記的供體蠟塊上取樣；將點(diǎn)樣針取出的樣本，填入受體蠟塊的蠟孔中；組織芯片蠟塊面朝下，放在一玻片上輕拍，使組織芯片蠟塊表面整齊；將組織芯片蠟塊放在65 ℃烤箱中30 min，使其完全熔合；將自然冷卻的組織芯片蠟塊放在冷凍臺上5 min，制備完畢。

1.2.2 免疫組織化學(xué)SP法 主要試劑：鼠抗人HER2單克隆抗體(克隆系CB11)、即用型SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)。組織芯片蠟塊切片脫蠟后至水；蒸餾水沖洗， 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)浸5 min；3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS液沖洗3次，每次2 min；滴加稀釋的HER2抗體(1∶100)，37 ℃孵育2 h；PBS液沖洗3次，每次2 min；滴加試劑1(二氨基聯(lián)苯胺底物濃縮液),37 ℃孵育20 min，PBS液沖洗3次，每次2 min；滴加試劑2(二氨基聯(lián)苯胺底物緩沖液)，37 ℃孵育20 min，PBS液沖洗3次，每次2 min；顯色劑顯色；自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明，封片。用PBS代替HER2抗體作為陰性對照，陽性對照為已知的HER2陽性乳腺癌組織切片。

1.2.3 FISH 主要試劑：GLP HER2/CSP 17探針和蛋白酶K(北京金菩嘉公司)。將組織切片65 ℃下烘烤3 min；將組織切片浸于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10 min，隨后浸入100%乙醇中5 min；室溫下，將組織切片依次置于100%、85%和70%乙醇中各2 min復(fù)水。組織切片室溫浸入去離子水中3 min，用無絨紙巾吸取多余的水分。100 ℃沸水煮玻片20 min，濃度為100 μg/ml的蛋白酶K中消化；將組織切片置于核酸雜交漂洗液中漂洗5 min,漂洗2次。1%甲醛室溫固定10 min。玻片依次置于-20 ℃預(yù)冷的70%、85%和100%乙醇中各2 min脫水；將組織切片室溫浸入丙酮溶液中2 min。自然干燥玻片。加熱玻片至56℃。將10 μl探針混合物滴加于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封片，準(zhǔn)備雜交儀器。共變性條件：83 ℃ 5 min，42 ℃ 16 h。玻片洗滌：0.3%乙基苯基聚乙二醇 65 ℃沖洗1.5 min, 0.1%乙基苯基聚乙二醇室溫沖洗30 s,70%乙醇沖洗3 min。暗處自然干燥玻片；室溫中將15 μl 4,6-二氨基-2-苯基吲哚復(fù)染劑滴加于玻片雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20 min，在Olympus BX51型熒光顯微鏡下，選用合適的濾片組觀察玻片。雜交成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為多于75%的細(xì)胞核內(nèi)有2個或2個以上HER2信號。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色，判定為陽性細(xì)胞，以陽性細(xì)胞為基礎(chǔ)，結(jié)合細(xì)胞的染色強(qiáng)度來判定抗原的表達(dá)強(qiáng)度。陽性細(xì)胞的比例<10%為陰性，10%～30%為弱陽性，>30%為強(qiáng)陽性；熒光原位雜交結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)數(shù)30個細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值(Ratio值=30個細(xì)胞核中紅信號總數(shù)/30個細(xì)胞核中綠信號總數(shù))。Ratio<1.8為陰性結(jié)果，提示該樣本無HER2基因擴(kuò)增；Ratio>2.2為陽性結(jié)果，提示樣本中HER2基因發(fā)生擴(kuò)增；Ratio在1.8～2.2時，可增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個,或重做FISH實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，樣本大于40時，采用χ2檢驗(yàn)；樣本小于40時，采用確切概率法；P<0.05時，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕組織及正常皮膚組織中HER2的蛋白表達(dá)

HER2蛋白定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，表達(dá)于表皮、真皮乳頭層及網(wǎng)狀層的部分成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中。10例正常皮膚組織未見著色；成熟瘢痕4例陽性，陽性率為25%；增生性瘢痕6例陽性，陽性率為66.67%；瘢痕疙瘩34例陽性，陽性率為85%。HER2蛋白在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的陽性表達(dá)率，較正常皮膚及成熟瘢痕高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。增生性瘢痕與瘢痕疙瘩相比，HER2的蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1和圖1，2。

2.2 瘢痕組織及正常皮膚組織中HER2的基因擴(kuò)增

10例正常皮膚組織中，均無HER2基因擴(kuò)增，成熟瘢痕有2例HER2基因擴(kuò)增,陽性率為12.50%；增生性瘢痕有5例基因擴(kuò)增，陽性率為55.56%；瘢痕疙瘩有32例基因擴(kuò)增，陽性率為80.00%。HER2基因在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的擴(kuò)增陽性率，較正常皮膚及成熟瘢痕高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。增生性瘢痕與瘢痕疙瘩相比，HER2的基因擴(kuò)增陽性率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1和圖3。

3 討論

表1 瘢痕組織及正常皮膚組織中HER2的蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增

注：a,b與正常皮膚和成熟瘢痕比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

定位于人染色體17q12-21.23的HER2基因，編碼一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體蛋白與HER家族成員及其配體之間相互作用，通過細(xì)胞間信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、生存、分化和增殖[3]。研究表明，HER2在多種腫瘤中過度表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[4-8]。Finigan等[9]報(bào)道，去整合素金屬蛋白酶17-神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1-人類表皮生長因子受體2(ADAM17-NRG-1-HER2)通路，在白介素1β(interleukin-1，IL-1β)介導(dǎo)的急性肺損傷中起著重要作用，且在其他哮喘及囊性纖維化中也發(fā)揮重要作用。HER2的激活，使得肺泡及氣管上皮屏障功能損傷并出現(xiàn)肺水腫。Faress等[10]報(bào)道，在肺損傷的患者中，阻斷HER2基因，發(fā)現(xiàn)肺纖維程度減弱，膠原沉積少，并提高肺損傷患者的存活率。

本研究結(jié)果表明，在病理性瘢痕組織中HER2表達(dá)增高。Gu等[11]報(bào)道，在大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合中，HER2在修復(fù)早期成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管及表皮細(xì)胞中表達(dá)陽性，在成熟瘢痕形成后，很快轉(zhuǎn)陰。而本研究結(jié)果顯示，人在創(chuàng)傷且病理性愈合后，HER2表達(dá)未轉(zhuǎn)陰，反而表達(dá)更高，提示HER2基因可能對病理性瘢痕的形成起重要作用。HER2對于病理性瘢痕形成的機(jī)制，可能是通過磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PI3K-Akt)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化和增殖。因此，HER2很可能通過PI3K-Akt 途徑促進(jìn)病理性瘢痕形成[12]。

本研究提示，HER2與病理性瘢痕的形成密切相關(guān)。目前，一些藥物能干擾HER2表達(dá)，如赫賽汀在乳腺癌治療中的應(yīng)用，已成為靶向治療的成功范例[13]。對HER2的表達(dá)或者功能進(jìn)行干預(yù)，是否能對病理性瘢痕起到治療作用，尚值得探討。

圖1 組織芯片免疫組織化學(xué)切片圖2 組織芯片免疫組織化學(xué)SP法檢測HER2蛋白表達(dá)情況 a.正常皮膚組織HER2蛋白陰性表達(dá)(×200) b.病理性瘢痕表皮HER2蛋白陽性表達(dá)(×200) c.病理性瘢痕真皮HER2蛋白陽性表達(dá)(×200 )圖3 FISH方法檢測HER2基因擴(kuò)增情況 a.正常皮膚組織HER2基因無擴(kuò)增 b.病理性瘢痕HER2基因擴(kuò)增

Fig1 Tissue microarray immunohistochemisry sections.Fig2 Detection of the HER2 protein expression by tissue microarray immunohistochemistry SP method. a. Expression of HER2 protein was negative in normal skin tissues (×200 ). b. the positive expression of HER2 protein in pathological scar epidermis (×200 ). c. the positive expression of HER2 protein in pathological scar dermal (×200 ).Fig3 Detection of the amplification of HER2 gene by FISH method. a. normal skin tissue without HER2 gene amplification. b. amplification of HER2 gene in pathological scar.

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ExpressionofHER2protein,geneamplificationanditsclinicalsignificanceinpathologicalscar

XIAOMing-ming,HOUHui,RENQiu-hua,etal.
(DepartmentofPathology,People′sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

ObjectiveTo explore the expression of HER2 in normal skin tissue, mature scar pathological scar and its clinical significance.MethodsImmune fluorescence in situ hybridization and tissue microarray immunohistochemical SP method were adopted to detecte HER2 protein expression and gene amplification in 10 cases of normal skin, 16 cases of mature scar, 9 cases of hyperplastic scar and 40 cases of keloid.ResultsThe positive expression of HER2 proteins in normal skin, mature scar, hyperplastic scar and keloid were 0, 25.00%, 66.67%, 85.00%, respectively; The positive rates of HER2 gene amplification in normal skin, mature scar, hyperplastic scar and keloid were 0, 12.50%, 55.56%, 80.00%, respectively. Comparing with normal skin and mature scar, the expression level of HER2 protein and gene amplification in pathological scar was higher (P<0.05).ConclusionEnhanced expression of HER2 in pathological scar, suggesting that HER2 may be involved in the formation of pathological scar, so HER2 targeted treatment of scar has certain prospect of clinical application.

Human epidermal growth factor receptor-2； Scar； Immunofluorescence； Immunohistochemistry

R619.6

A

1673-7040(2014)02-0122-04

2013-11-02)

110016 遼寧 沈陽，遼寧省人民醫(yī)院(病理科：肖明明，侯 慧，任秋華，高 爽，景士兵；骨腫瘤科：杜振廣)

肖明明(1978-)，女，內(nèi)蒙古牙克石人，主治醫(yī)師，碩士研究生.

景士兵，110016，遼寧省人民醫(yī)院 病理科，電子信箱：mypathology@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.02.020