肖夢榕，張梁，劉雙平，石貴陽

江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122

在大腸桿菌中，葡萄糖的主要吸收形式是通過磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system，簡稱PTS系統(tǒng))[1]以基團轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行，此系統(tǒng)參與細(xì)胞發(fā)酵過程中葡萄糖吸收、運輸和磷酸化的過程，消耗大量芳香族氨基酸合成前體物質(zhì)磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)，并導(dǎo)致乙酸生成，TCA循環(huán)與糖酵解循環(huán)之間碳流分配不均衡，副產(chǎn)物增多，主產(chǎn)物產(chǎn)率降低，菌體二次生長，碳源利用效率低等不良后果[2]。PTS系統(tǒng)由可溶性非底物特異性蛋白EⅠ (ptsH編碼)、磷酸組氨酸搬運蛋白HPr (ptsI編碼)和酶Ⅱ (EsⅡ)構(gòu)成[3-4]。EⅠ可將來自PEP的磷酰基團依次傳遞給HPr、EsⅡ和葡萄糖，從而完成葡萄糖磷酸化轉(zhuǎn)運。EsⅡ是一系列蛋白，可以特異性識別和轉(zhuǎn)運底物分子，大腸桿菌染色體中編碼約有20種EsⅡ，參與20多種不同碳水化合物的磷酸化轉(zhuǎn)運，其中 EⅡGlc和 EⅡMan主要參與葡萄糖的轉(zhuǎn)運。EⅡGlc主要由可溶性酶EAⅡGlc(crr編碼)，以及膜透性酶ECBⅡGlc(ptsG編碼)構(gòu)成[5]。研究表明[5-8]PTS缺陷株能夠有效減小葡萄糖轉(zhuǎn)運速率，平衡胞內(nèi)糖酵解循環(huán)和三羧酸循環(huán)之間的碳流代謝，進(jìn)而減少乙酸分泌，有利于高密度發(fā)酵。但同時發(fā)現(xiàn)PTS缺陷株生長受到限制，延滯期較長，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。來源于運動發(fā)酵單胞菌 Zymomonas mobilis中的葡萄糖易化體蛋白Glf是一種轉(zhuǎn)運蛋白，能夠促進(jìn)葡萄糖吸收[9-12]，Km=4.1×103μmol/L。Ren等[13]研究顯示表達(dá) Glf蛋白能夠明顯減弱碳代謝阻遏效應(yīng) (CCR)，提高碳源利用效率。Yi等[14]通過在 PTS?菌株中表達(dá)插入Glf蛋白和葡萄糖激酶蛋白Glk (glk編碼)的質(zhì)粒，改造后的菌株產(chǎn)率能夠達(dá)到與表達(dá)GalP-Glk途徑的菌株相似的效果，可見，Glf轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是一種較為有效的葡萄糖活性磷酸化轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，然而目前少有關(guān)于Glf系統(tǒng)的染色體水平整合表達(dá)的報道。本研究利用 Red重組技術(shù)[15]構(gòu)建了大腸桿菌ptsG、ptsI敲除菌，在敲除ptsI基因的同時在染色體上插入了glf基因，測定了重組菌的生長性能，為后續(xù)構(gòu)建生產(chǎn)莽草酸及其他芳香族氨基酸工程菌株打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

E. coli W3110，Zymomonas mobilis (ATCC 31821)和同源重組的協(xié)助質(zhì)粒pKD46 (溫敏型復(fù)制子，帶有氨芐青霉素抗性，阿拉伯糖誘導(dǎo)后表達(dá)λ噬菌體重組酶 Gam，Bet和Exo)均為本實驗室保藏；同源重組抗性打靶片段質(zhì)粒PKD13和抗性消除質(zhì)粒pCP20均購于美國耶魯大學(xué)大腸桿菌菌株庫 (CGSC，E. coli Genetic Stock Center，New Haven，USA)[15]。重組菌株E. coli G1、I1、I2均為本研究中構(gòu)建，各菌株及質(zhì)粒見表1。

1.1.2 工具酶及試劑

實驗中各種DNA限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和Hind Ⅲ、Taq DNA 聚合酶、dNTP Mixture、Rnase均為Fermentas公司產(chǎn)品；氨芐青霉素 (Amp)、氯霉素 (Cm)、卡那霉素 (Kan)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；L-阿拉伯糖購自Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇 (上海)貿(mào)易有限公司；pMD18-T Vector購自寶生物工程有限公司；Q5高保真聚合酶購自NEB (北京)有限公司；酵母粉、蛋白胨購自O(shè)XOID公司；本研究中使用的試劑盒：質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、純化試劑盒、膠回收試劑盒都來自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

普通大腸桿菌培養(yǎng)采用LB液體培養(yǎng)基 (/L)：10 g蛋白胨，5 g酵母粉，10 g NaCl，重組大腸桿菌構(gòu)建過程中均采用 SOB液體培養(yǎng)基 (/L)：20 g蛋白胨，5 g 酵母粉，0.5 g NaCl，0.186 g KCl，0.95 g MgCl2，固體培養(yǎng)基需另加1.5%的瓊脂粉。

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

培養(yǎng)運動發(fā)酵單胞菌采用T培養(yǎng)基 (/L)：20 g 葡萄糖，10 g酵母粉，2 g KH2PO4，1 g (NH4)2SO4，1 g MgSO4·7H2O，28 ℃靜置，厭氧培養(yǎng)。

重組大腸桿菌發(fā)酵實驗使用 FM 培養(yǎng)基(/L)：3 g MgSO4·7H2O，3 g KH2PO4，1 g NaCl，5 g (NH4)2SO4；另添加微量元素[(μmol/L)：FeCl3·6H2O 8.88，CoCl2·6H2O 1.26，CuCl2·2H2O 0.88，ZnCl22.20，Na2MoO4·2H2O 1.24，H3BO31.21，MnCl2·4H2O22.5]。并根據(jù)需要加入適量葡萄糖。發(fā)酵實驗初始值為50 g/L。為了防止培養(yǎng)過程中菌體產(chǎn)酸影響菌體生長，在搖瓶培養(yǎng)過程中添加10 g/L碳酸鈣 (發(fā)酵罐中培養(yǎng)使用氨水)以中和pH[16]。

氨芐青霉素、氯霉素和卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作濃度分別為100 μg/mL、25 μg/mL和50 μg/mL，大腸桿菌的培養(yǎng)溫度如無特殊說明均指37 ℃。

1.1.4 引物

本實驗中所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體序列見表2。

1.2 方法

1.2.1 運動發(fā)酵單胞菌基因組DNA提取

具體方法參見文獻(xiàn)[17]。

1.2.2 glf基因的克隆

以運動發(fā)酵單胞菌 Zymomonas mobilis的glf基因 (GenBank Accession No. ATCC 31281)為模板設(shè)計引物IF1和IF2 (表2)，其中下劃線為ptsI基因上下游同源臂。

表2 本研究中所用引物Table 2 Primers used in this research

以運動發(fā)酵單胞菌的染色體為模板，以 IF1、IF2為引物進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增體系為：ddH2O 38.5 μL，10×Ex Taq 緩沖液 5 μL，dNTPs 4 μL，上下游引物各 1 μL，模板 1 μL，Ex Taq酶 0.5 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析，PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18 T-Vector載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆。挑取陽性克隆接種至氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基中，提質(zhì)粒用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切驗證。將驗證正確的克隆子送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 PCR打靶片段的制備

以PKD13質(zhì)粒為模板，以打靶基因上下游同源臂為引物，Q5高保真聚合酶進(jìn)行 PCR擴增。PCR 擴增體系為：ddH2O 33.5 μL，5×Q5緩沖液 10 μL，dNTPs 4 μL，上下游引物各 1 μL，模板1 μL，Q5高保真聚合酶 0.5 μL。PCR 擴增條件為：98 ℃預(yù)變性 30 s，98 ℃變性 10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸2 min。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物割膠回收并純化。

1.2.4 目的基因的敲除、抗性片段的丟失及陽性轉(zhuǎn)化子鑒定

目的基因的敲除：首先制備帶有輔助質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；將10 μL打靶片段與100 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1 mm電轉(zhuǎn)杯中，1 800 V電擊轉(zhuǎn)化，立即加入1 mL SOB培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2?4 h后涂布Kan抗性平板。

抗性片段丟失：敲除菌陽性菌落在抗性平板劃線分離純化后再次制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，以相同的方法電擊轉(zhuǎn)化入輔助質(zhì)粒pCP20，涂布Cm抗性平板。

陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定：在抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，以驗證引物進(jìn)行PCR鑒定是否正確；劃線分離純化驗證正確的陽性菌落，37 ℃下傳代丟失溫敏輔助質(zhì)粒。

1.2.5 菌體生長曲線

分別挑取重組菌E. coli G1、I1、I2的單菌落于5 mL LB，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜后取等量菌體轉(zhuǎn)接至70 mL FM培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，定時測定600 nm下菌體密度，同時保留部分樣品以測定發(fā)酵液中葡萄糖濃度及乙酸含量。

1.2.6 重組大腸桿菌在發(fā)酵罐中的發(fā)酵實驗

將重組菌株接種于SOB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 h，收集適量菌體，以LB培養(yǎng)基重懸后在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，作為發(fā)酵罐的種子液。發(fā)酵罐裝液量為6 L，接種量為5 %，初始葡萄糖濃度 50 g/L。初始通氣量為1 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，菌體生長過程中適時調(diào)節(jié)空氣流量 (1?7 L/min)和攪拌轉(zhuǎn)速(200?1 000 r/min)使得溶解氧濃度大于30%，以10% (V/V)硫酸溶液和氨水控制pH值為7，37 ℃恒溫發(fā)酵60 h。

1.2.7 葡萄糖含量和乙酸含量的測定

發(fā)酵液中葡萄糖濃度檢測采用生物傳感儀SBA-40C (山東省微生物研究所研制)，發(fā)酵液中乙酸濃度采用 HPLC檢測，泵為 SHIMADAZU LC-10AT，進(jìn)樣器為 Dionex UltiMate Autosampler 3000，色譜柱為Shodex SH1011，示差檢測器Shodex RI101，流動相為0.01 mol/L H2SO4，流速0.8 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的敲除

將打靶片段按電擊轉(zhuǎn)化方法敲除目的片段，通過PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。其中E. coli G1鑒定引物為YG1/YG2，E. coliⅠ1的鑒定引物為YI1/YI2。經(jīng)PCR驗證 (圖1)，用YG1/YG2擴增，出發(fā)菌株獲得1 700 bp大小的電泳圖譜；轉(zhuǎn)化子 G1’ (△ptsG::kan)獲得 1 600 bp左右的電泳圖譜；其抗生素抗性基因丟失后，轉(zhuǎn)化子G1獲得650 bp大小電泳圖譜。即菌株G1的ptsG基因已經(jīng)被成功敲除。利用相似的策略進(jìn)行敲除ptsI基因的驗證。以引物YI1/YI2擴增，出發(fā)菌株獲得1 700 bp大小的電泳圖譜 (圖2)；轉(zhuǎn)化子Ⅰ1’ (△ptsI::kan)PCR 擴增后電泳大小約為1 400 bp；經(jīng)FRT重組而刪除卡那霉素基因的轉(zhuǎn)化子Ⅰ1電泳圖譜大小為200 bp。表明菌株Ⅰ1的ptsI基因已被成功敲除。通過上海生工生物工程公司測序確認(rèn)，成功敲除了ptsG和ptsI基因，獲得E. coli G1、Ⅰ1兩株重組大腸桿菌。

圖1 ptsG基因缺失菌株的PCR鑒定電泳圖譜Fig. 1 PCR identification of ptsG knockout mutant.M: 1 kb ladder marker; 1: W3110 PCR product; 2: G1’(△ptsG::kan)PCR product; 3: G1 (△ptsG)PCR product.

圖2 ptsI基因缺失菌株的PCR鑒定電泳圖譜Fig. 2 PCR identification of ptsI knockout mutant.M: 1 kb ladder marker; 1: W3110 PCR product; 2: I1’(△ptsI::kan)PCR product; 3: I1 (△ptsI)PCR product.

2.2 外源基因在染色體上的整合表達(dá)

按圖3制備打靶片段ptsI’::kan-glf，為了最大限度降低外源基因染色體水平表達(dá)對原始菌株可能造成的影響，本研究并未對glf基因的啟動子和ORF進(jìn)行添加或刪除的改動，僅從ptsI基因的起始密碼子 ATG開始，完全替換為 glf基因，即glf基因完全利用ptsI基因所使用的啟動子、ORF及核糖結(jié)合位點。通過電擊轉(zhuǎn)化敲除目的片段并在染色體上插入外源基因，PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。E. coli I2鑒定引物為YI1/YI2。經(jīng)PCR驗證 (圖4)，用YI1/YI2擴增，出發(fā)菌株獲得 1 800 bp大小的電泳圖譜；轉(zhuǎn)化子 I2’(△ptsI::glf::kan)獲得3 000 bp左右的電泳圖譜；刪除卡那霉素篩選標(biāo)記基因后，篩選得到陽性克隆I2經(jīng)PCR擴增電泳圖譜大小約為1 600 bp。結(jié)果表明菌株I2的ptsI基因已被成功替換為glf基因。通過上海生工生物工程公司測序確認(rèn)，成功將ptsI基因替換為glf基因，獲得E. coli I2重組大腸桿菌。

圖3 同源重組打靶片段ptsI’::kan-glf的制備Fig. 3 Construction of ptsI’::kan-glf used for homologous recombination.

圖4 缺失 ptsI基因同時插入 glf基因菌株的 PCR鑒定電泳圖譜Fig. 4 PCR identification of ptsI knock-out and glf knock-in mutant. M: 1 kb ladder marker; 1: W3110 PCR product; 2: I2’ (△ptsI::glf::kan)PCR product; 3: I2(△ptsI::glf)PCR product.

2.3 E. coli W3110、G1、I1及I2生長代謝特征比較

2.3.1 FM發(fā)酵培養(yǎng)基中生長性能

從圖 5可以看出，在 FM發(fā)酵培養(yǎng)基中，G1重組大腸桿菌比生長速率為 0.37 g/(h·L)，與W3110 (0.42 g/(h·L))相近，最終生物量 (2.74 g/L)略高于W3110 (2.34 g/L)；而I1重組大腸桿菌的延滯期較長，前期生長緩慢，最高生長速率僅為 0.34 g/(h·L)(表 3)，低于 W3110。但發(fā)酵后期生長顯著加快，對數(shù)生長期延長，發(fā)酵結(jié)束時生物量達(dá)到3.48 g/L，約為W3110的1.5倍，表明I1具有高密度發(fā)酵優(yōu)勢。將I1進(jìn)一步進(jìn)行分子改造，插入外源基因glf，在FM培養(yǎng)基中測定重組菌的生長性能。經(jīng)過分子手段改造之后，I2重組菌生長性能較I1重組菌明顯提高，改善了I1前期生長緩慢的缺陷，最高生長速率可達(dá)0.63 g/(h·L)；同時保留了I2生長對數(shù)期較長和可進(jìn)行高密度發(fā)酵的優(yōu)勢，發(fā)酵結(jié)束菌體生物量可達(dá)4.68 g/L，約為I1的1.3倍。顯然，通過在染色體組上插入glf基因能夠顯著改善敲除菌的生長缺陷，具有高密度發(fā)酵的優(yōu)勢。

為進(jìn)一步探討重組菌的高密度發(fā)酵性能，對重組菌進(jìn)行了發(fā)酵罐放大實驗 (圖 6)，生長曲線與搖瓶結(jié)果基本符合。重組菌E. coli I2最高生物量可達(dá)17.40 g/L (OD600=45.8)，為野生型大腸桿菌 (OD600=25.1)的 1.82倍，充分說明了重組菌在生長方面具有的顯著優(yōu)勢。

2.3.2 FM培養(yǎng)基中重組菌生長代謝特征

圖5 重組大腸桿菌E. coli W3110、G1、I1、I2在搖瓶中的生長情況Fig. 5 The growth curve of recombinant strains E. coli W3110 and its mutants G1, I1, I2.

表3 搖瓶發(fā)酵參數(shù)比較Table 3 Comparison of parameters in shake-flask experiments

圖6 重組大腸桿菌E. co li W3110、I2在6 L發(fā)酵罐中的生長情況Fig. 6 The growth curve of recombinant strains E. coli W3110 and its mutants I2 in a 6 L bioreactor.

為了較為準(zhǔn)確地測定重組菌利用葡萄糖的能力，本研究中采用 FM 發(fā)酵培養(yǎng)基以消除其他碳源物質(zhì)對菌體生長的影響，初始添加葡萄糖為50 g/L。測得葡萄糖消耗曲線及乙酸生成曲線如圖 7所示。通過相關(guān)公式[18]計算得出表 3中數(shù)據(jù)，其中消耗葡萄糖量分別為I2>W3110>G1>I1，葡萄糖比消耗速率分別為W3110>G1>I2>I1。表明ptsI基因的敲除對大腸桿菌吸收利用葡萄糖影響較大，而重新插入外源基因glf后重組菌吸收葡萄糖能力又得到恢復(fù)。此結(jié)果在發(fā)酵罐中也得到了進(jìn)一步驗證，在發(fā)酵罐中，葡萄糖消耗量為I2 (103.2 g)>W3110 (75.4 g)，葡萄糖比消耗速率為 W3110 (7.03 g/(h·L))>I2 (4.75 g/(h·L))。

同時，本研究還考察了各重組菌株的乙酸生成情況。結(jié)果顯示，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束時，乙酸產(chǎn)量W3110>G1>I1>I2，在發(fā)酵罐中經(jīng)過驗證結(jié)果相符，重組菌I2在整個發(fā)酵過程中消耗氨水為687 g，而W3110消耗氨水達(dá)1 156 g，是重組菌的近1.7倍?？梢钥吹剑脑?PTS系統(tǒng)后重組菌產(chǎn)酸水平大幅度下降，而Glf蛋白在恢復(fù)菌體葡萄糖利用能力的同時并未造成乙酸的大量生成，有利于重組菌進(jìn)行高密度發(fā)酵。

圖7 重組大腸桿菌E. coli W3110、G1、I1、I2在搖瓶中的生長代謝情況Fig. 7 Acetic acid production and glucose consumption of strains E. coli W3110 and its mutants G1, I1, I2. ■, □: E. coli W3110; ●, ○: E. coli G1; ▲, △:E. coli I1; ▼, ▽: E. coli I2. Solid shape: consumption curve of glucose; Hollow shape: accumulation curve of acetic acid.

3 討論

本研究利用 Red重組技術(shù)刪除了大腸桿菌中PTS系統(tǒng)關(guān)鍵組分ECBⅡGlc的編碼基因(ptsG)和磷酸組氨酸搬運蛋白 HPr的編碼基因(ptsI)。通過搖瓶發(fā)酵，并在6 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了重組菌的進(jìn)一步驗證，結(jié)果表明：ptsG和ptsI基因的刪除均能夠?qū)Υ竽c桿菌的生長產(chǎn)生影響。刪除了PTS系統(tǒng)相關(guān)基因的重組菌株對葡萄糖的吸收速率降低，從而降低菌體生長速率，代謝產(chǎn)物乙酸生成減少，其中 ptsI基因刪除后效果更為顯著。同時，PTS系統(tǒng)的部分失活能夠解除分解物代謝阻遏效應(yīng)，使菌株生長能夠獲得更高的菌密度。相比△ptsG重組菌 G1，△ptsI重組菌I1徹底阻斷了葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運途徑，通過半乳糖透性酶 (GalP)介導(dǎo)的活性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)磷酸化轉(zhuǎn)運葡萄糖至胞內(nèi)[19-21]，不消耗 PEP，增加了產(chǎn)物合成前體，提高底物利用效率，有利于進(jìn)一步構(gòu)建高效合成芳香族氨基酸工程菌。但由于GalP轉(zhuǎn)運系統(tǒng)誘導(dǎo)發(fā)生作用需要 H+協(xié)同參與等一系列條件[19-21]，使得△ptsI重組菌I1生長能力受到限制，生長緩慢，延滯期較長，并不適合工業(yè)化應(yīng)用。

由于重組菌 G1仍然能夠利用 PTS途徑中的EⅡMan等運輸體轉(zhuǎn)運葡萄糖[22]，并利用PEP提供磷酸基團對其磷酸化，降低胞內(nèi)PEP水平，故在生長特性等方面與原始菌株并無顯著差異，因此不再進(jìn)行進(jìn)一步改造。本研究在E. coli W3110染色體上敲除ptsI基因的同時整合表達(dá)了來源于運動發(fā)酵單胞菌Zymononas Mobilis的Glf蛋白，構(gòu)建了重組菌I2。該重組菌葡萄糖利用效果顯著，表現(xiàn)出多種優(yōu)于I1的生長優(yōu)勢。這是因為 glf基因表達(dá)的葡萄糖易化體 Glf同GalP類似，也是一種轉(zhuǎn)運蛋白，能夠促進(jìn)葡萄糖吸收，但其與GalP蛋白相比不需要過多限制條件，減輕了膜孔蛋白向胞內(nèi)運輸?shù)膲毫Γ且环N較為有效的葡萄糖活性磷酸化轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。通過整合表達(dá) glf基因，重組菌 I2能夠通過Glf-glk (葡萄糖易化體-葡萄糖激酶)途徑，利用ATP 將葡萄糖進(jìn)行磷酸化并轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。本研究結(jié)果表明 Glf蛋白能夠在染色體上成功表達(dá)并介導(dǎo)葡萄糖的磷酸化轉(zhuǎn)運，顯著改善了PTS缺陷型菌株的生長劣勢。Glf系統(tǒng)相比較PTS系統(tǒng)減少了莽草酸合成途徑中重要前體磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)的損失，降低了副產(chǎn)物乙酸的生成，使TCA循環(huán)與糖酵解循環(huán)之間碳流分配趨向平衡，菌體恢復(fù)生長能力，從而實現(xiàn)菌體的高密度發(fā)酵。研究顯示[9-12]Glf蛋白能夠顯著減弱碳代謝阻遏效應(yīng)，激活多個基因更有效利用復(fù)合培養(yǎng)基水解產(chǎn)物維持菌體生長，提高碳源的利用率，與本文結(jié)果一致。但是也有文獻(xiàn)報道[14]，Glf蛋白雖然與GalP蛋白轉(zhuǎn)運效率相似，但從動力學(xué)參數(shù)顯示Glf所需的葡萄糖底物濃度較高，由此也說明在進(jìn)一步改造獲得發(fā)酵產(chǎn)物過程中需要對底物濃度進(jìn)行控制。

Chandran等[23]通過不同質(zhì)粒分別表達(dá) Glf和Glk蛋白使PTS?宿主菌重新獲得吸收葡萄糖的能力，結(jié)果顯示，未表達(dá)Glf蛋白的PTS型大腸桿菌莽草酸產(chǎn)率低于同時表達(dá) Glf和 Glk蛋白的菌株，可見Glf和Glk蛋白協(xié)同作用能夠?qū)ζ咸烟堑奈掌鸬酱龠M(jìn)效果。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，刪除了大腸桿菌PTS系統(tǒng)關(guān)鍵操縱子(ptsH-I-crr)后的菌株表現(xiàn)出了極高的莽草酸產(chǎn)率 (27%)和較低副產(chǎn)物水平，在添加15 g/L酵母提取物的10 L罐中效果更為顯著。由此可見，游離表達(dá) Glf蛋白能夠促進(jìn)甚至完全替代 PTS系統(tǒng)的功能，經(jīng)過改造后的大腸桿菌重組菌在莽草酸生產(chǎn)應(yīng)用方面具有顯著優(yōu)勢，此研究更進(jìn)一步提示我們可以將 Glf蛋白結(jié)合到大腸桿菌染色體上，以提高菌株的遺傳穩(wěn)定性。

Tang等[24]在大腸桿菌 ATCC 8739 PTS–菌株染色體上整合表達(dá)了Glf和Glk蛋白，考察了其在厭氧條件下的細(xì)胞生長和葡萄糖利用性能，并與 GalP轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明表達(dá)Glf蛋白菌株的葡萄糖消耗速率為0.7 g/(h·L)，高于GalP轉(zhuǎn)運系統(tǒng)30%，而同時表達(dá)Glf和Glk蛋白的重組菌葡萄糖消耗速率可達(dá)2.13 g/(h·L)，對本研究后續(xù)進(jìn)一步修飾改造提供了思路，研究同時也指出Glf轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在生產(chǎn)以PEP為前體的產(chǎn)物如琥珀酸等具有顯著優(yōu)勢。

目前對于PTS系統(tǒng)改造主要針對于表達(dá)大腸桿菌的GalP系統(tǒng)[8,23,25-26]，Glf蛋白多見于游離表達(dá)，而整合表達(dá)具有穩(wěn)定遺傳，避免抗生素的使用等優(yōu)點，但目前相關(guān)報道較少。本研究利用改造大腸桿菌中的PTS系統(tǒng)為基礎(chǔ)，在染色體上整合表達(dá) Glf蛋白能夠構(gòu)建高密度發(fā)酵重組菌，重組菌具有葡萄糖利用率高，菌體最終生物量高，副產(chǎn)物乙酸產(chǎn)量少等優(yōu)勢，是一株具有較高改造價值的優(yōu)勢菌株，但仍存在延滯期較長等缺點，同時限于培養(yǎng)基條件，重組菌的生長還有一定的上升空間，有待進(jìn)一步對培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件等進(jìn)行優(yōu)化探究。我們將對該菌株進(jìn)行進(jìn)一步基因改造和完善，調(diào)控Glf蛋白的表達(dá)以改善菌體生長行為，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以縮短重組菌延滯時間，提高生物量累積，為以后構(gòu)建高效合成芳香族氨基酸工程菌打下基礎(chǔ)。

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