歐陽(yáng)霞輝，侯蘭新，高丹丹，陳 紅

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030）

在哺乳動(dòng)物中，雌激素及其受體既影響乳腺、子宮和卵巢等生殖系統(tǒng)的生長(zhǎng)、分化及功能，又對(duì)骨骼、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用［1］.雌激素受體一旦與雌激素結(jié)合，就會(huì)發(fā)生變構(gòu)形成二聚體，然后與雌激素受體反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）結(jié)合，刺激靶基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)雌激素促進(jìn)細(xì)胞增生、分化和維持正常的生理功能［2］.ERR（Estrogen related receptor，ERR）屬于孤兒核因子受體，在結(jié)構(gòu)上和ER非常類(lèi)似，它們和ER共同構(gòu)成核因子受體超家族的第三亞族，能夠直接與類(lèi)固醇受體共激活子結(jié)合激活靶基因的表達(dá) .與ER不同的是，它們不與雌激素結(jié)合，但能夠與雌激素應(yīng)答元件結(jié)合［3］，表明在與共同的共激活子作用時(shí)它們之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)作用［4］.

哺乳動(dòng)物ERRs存在于ERs存在的多種靶器官和組織 .對(duì)鼠類(lèi)的研究發(fā)現(xiàn)，ERRα在各種胚胎組織中都有表達(dá)，在胚胎干細(xì)胞中也能檢測(cè)到ERRαmRNA的表達(dá)，表明ERRα與眾多生理和發(fā)育過(guò)程有關(guān) .幾乎在老鼠每一種成體組織中都有ERRα表達(dá)，而且在大腦、心臟、骨骼肌、腎、精巢和子宮等部位有高度表達(dá)［5，6］.ERRα在ERα存在的丘腦和視丘下部和垂體前葉也有表達(dá)，推測(cè)它也可能參與了生殖調(diào)控，對(duì)ERα的表達(dá)起反饋調(diào)節(jié)作用［5］.ERRβ的mRNA表達(dá)從原始生殖細(xì)胞遷移到生殖脊開(kāi)始，一直持續(xù)到兩性性別出現(xiàn)，ERRβ缺失引起生殖腺生殖細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，表明ERRβ明顯參與了生殖腺生殖細(xì)胞的增殖［7］.

盡管對(duì)哺乳動(dòng)物ERR的研究比較深入，但在昆蟲(chóng)類(lèi)，雖然Genebank中存在一些昆蟲(chóng)ERR的序列，也有對(duì)黑腹果蠅dERR配體的研究報(bào)道［8］，但是有關(guān)ERR功能的研究很少 .何慧等對(duì)黃臉油葫蘆雌激素相關(guān)受體TeERR的研究也發(fā)現(xiàn)，TeERR與黃臉油葫蘆的發(fā)育有關(guān)，在幼蟲(chóng)的胚胎期和生殖腺表達(dá)量很高［9］.為了了解pvERR在性腺中的表達(dá)情況，我們采用原位雜交技術(shù)對(duì)擬黑多刺蟻蟻后卵巢中和雄蟻精巢中pvERR mRNA的表達(dá)進(jìn)行了定位研究，以期為進(jìn)一步的功能研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的擬黑多刺蟻（Polyrhachis vicina）蟻后和雄蟻為研究對(duì)象 .飼養(yǎng)條件：溫度25～28℃，相對(duì)濕度80%，光周期12L∶12D.飼料為20%的白糖水和豆餅菜葉.采用經(jīng)過(guò)消毒的刀片迅速分別將蟻后、雄蟻的腹部切下，立即放入含有0.1%DEPC的多聚甲醛固定液中固定8h.

1.2 原位雜交

擬黑多刺蟻ERR原位雜交試劑盒（訂制）購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，試劑盒包括：胃蛋白酶；預(yù)雜交液；ERR寡核苷酸探針雜交液（根據(jù)所測(cè)擬黑多刺蟻ERR序列設(shè)計(jì)，5＇-tgaagcatatctggctcgcaagctgctaaggc-3＇，地高辛標(biāo)記），封閉液，生物素化鼠抗地高辛，SABC，生物素化過(guò)氧化物酶.

將固定好的材料放入30%蔗糖溶液中于4℃過(guò)夜，用冰凍包埋劑包埋，切片 .切片厚15μm，將切片粘于載玻片上，晾干備用 .實(shí)驗(yàn)流程如下：①洗滌 .將貼有材料的載玻片置于高壓滅菌的0.1%DEPC水中充分洗滌.②封閉內(nèi)源性酶：切片入0.3%H2O2室溫處理30min，0.1%DEPC水洗3次.③暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37℃消化5min.原位雜交用PBS洗3次，每次5min.④后固定：切片入1%多聚甲醛（含有0.1%DEPC）室溫固定10min，0.1%DEPC水洗3次.⑤預(yù)雜交：每張切片滴加20μL預(yù)雜交液，恒溫箱40℃預(yù)雜交4h.⑥雜交：每張切片滴加20μL雜交液，恒溫箱中40℃雜交過(guò)夜.⑦雜交后洗滌：37℃2×SSC洗5min×2次；37℃，0.5×SSC洗15min×1次；37℃0.2×SSC洗15min×2次.⑧滴加封閉液：37℃，30min.⑨滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃，60min，原位雜交用PBS洗4次，每次5min.⑩滴加SABC：37℃，30min，原位雜交用PBS洗3次，每次5min.[11]滴加生物素化過(guò)氧化物酶：37℃，30min，原位雜交用PBS洗4次，每次5min.[12]DAB顯色：鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般5～10min，蒸餾水終止反應(yīng) .梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片.Leica光學(xué)顯微鏡觀察.

陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)是以預(yù)雜交液代替雜交液進(jìn)行，其余步驟同上.

1.3 圖像分析

應(yīng)用Leica QWinV3圖像分析系統(tǒng)分別統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性反應(yīng)的平均灰度值（灰度分級(jí)為0～255級(jí)，0級(jí)為最黑的灰度，255級(jí)為最淺的灰度）.精巢和卵巢分別取5張組織切片，每張切片取6個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)灰度值，應(yīng)用SPSS 11.5的one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 .數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行LSD檢驗(yàn).

2 結(jié)果

2.1 擬黑多刺蟻蟻后卵巢pvERR基因的表達(dá)

采用地高辛標(biāo)記的特異寡核苷酸探針雜交結(jié)果顯示，pvERR mRNA在分化期早期的濾泡細(xì)胞胞質(zhì)中就有表達(dá)，一直持續(xù)到卵黃積累階段（圖版Ⅰ，1-4）；生長(zhǎng)期和卵黃形成期的卵母細(xì)胞胞質(zhì)中有pvERR mRNA陽(yáng)性反應(yīng)（圖版Ⅰ，3-4）.

2.2 擬黑多刺蟻雄蟻精巢pvERR基因的表達(dá)

變形期精細(xì)胞胞質(zhì)有pvERR mRNA陽(yáng)性反應(yīng)（圖版Ⅱ，1）.成熟精子的頭部和尾部有不同程度的pvERR mRNA陽(yáng)性表達(dá)（圖版Ⅱ，2-3）.

2.3 對(duì)照

以預(yù)雜交液代替雜交液的對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性（圖版Ⅰ，5-6；圖版Ⅱ，4）.

2.4 圖像分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

結(jié)果表明，卵子發(fā)生中，pvERR mRNA在濾泡細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的表達(dá)差異顯著 .在生長(zhǎng)期和卵黃形成期的卵母細(xì)胞表達(dá)差異顯著 .卵黃形成期卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞中的表達(dá)差異不顯著（表1）.精巢中，pvERR mRNA在變形期精細(xì)胞和成熟精子頭部和尾部的表達(dá)差異顯著（表1）.

表1 擬黑多刺蟻精卵發(fā)生過(guò)程中pvERR mRNA原位雜交陽(yáng)性反應(yīng)灰度值

圖1 pvERR mRNA在擬黑多刺蟻卵巢中的表達(dá)

3 討論

昆蟲(chóng)的生殖雖然受外界環(huán)境因子的影響，但主要受昆蟲(chóng)體內(nèi)的內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié) .外在因素的作用，常先刺激昆蟲(chóng)的感受器官，所產(chǎn)生的沖動(dòng)傳入神經(jīng)系統(tǒng)，由此影響內(nèi)分泌系統(tǒng)的活動(dòng)，內(nèi)分泌系統(tǒng)的化學(xué)信息傳遞到生殖器官，使后者產(chǎn)生相應(yīng)的生理反應(yīng)，生殖腺的活動(dòng)又能對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生反饋式調(diào)節(jié)作用［10］.在昆蟲(chóng)腦中存在促性腺激素（Gonadotrophins，GtH），昆蟲(chóng)性腺成熟及精卵成熟也依賴(lài)腦分泌的促性腺激素調(diào)節(jié)，它能誘導(dǎo)卵巢和精巢合成蛻皮激素，而蛻皮激素能夠促使脂肪體合成卵黃原蛋白、卵胞細(xì)胞的分化以及刺激精子的發(fā)生［11～14］.

3.1 pvERR基因在卵巢中的表達(dá)

擬黑多刺蟻卵巢屬于多滋式 .滋養(yǎng)細(xì)胞和卵母細(xì)胞都是由早期的卵原細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生，一個(gè)卵母細(xì)胞周?chē)袔资畟€(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞 .滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)染色體大量復(fù)制，使其轉(zhuǎn)錄活性升高，合成大量rRNA、mRNA，甚至完整的核糖體，并通過(guò)細(xì)胞質(zhì)橋單向運(yùn)輸給處在發(fā)育階段的卵母細(xì)胞 .在卵母細(xì)胞發(fā)育的一定階段滋養(yǎng)細(xì)胞分解，分解產(chǎn)物進(jìn)入卵母細(xì)胞 .濾泡細(xì)胞是體細(xì)胞，卵子發(fā)生早期階段，夾雜在生殖細(xì)胞之間 .隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，它包圍在卵母細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞周?chē)纬蔀V泡壁 .濾泡細(xì)胞不僅為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，并形成卵黃膜和卵殼，并且在卵母細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中提供發(fā)育信息［15］.

圖2 pvERR mRNA在擬黑多刺蟻精巢中的表達(dá)

本研究中原位雜交結(jié)果顯示，pvERR mRNA在卵子發(fā)生過(guò)程中濾泡細(xì)胞的胞質(zhì)都有陽(yáng)性表達(dá).隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，濾泡細(xì)胞中的表達(dá)量逐漸增加 .在卵黃積累階段，pvERR mRNA的表達(dá)量顯著減少 .而在卵母細(xì)胞，pvERR mRNA在生長(zhǎng)期和卵黃發(fā)生期表達(dá)，表達(dá)量是逐漸增加的 .在卵子發(fā)生分化階段，隨著滋養(yǎng)細(xì)胞和卵母細(xì)胞分化，濾泡細(xì)胞不斷增殖分裂，所以該時(shí)期pvERR mRNA的陽(yáng)性表達(dá)可能與濾泡細(xì)胞自身的增殖和分化有關(guān) .卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期和卵黃積累階段，濾泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的陽(yáng)性表達(dá)趨勢(shì)（濾泡細(xì)胞中逐漸減少，卵母細(xì)胞中逐漸增多）可能說(shuō)明濾泡細(xì)胞給卵母細(xì)胞提供了發(fā)育信息 .卵黃生成期卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的表達(dá)可能說(shuō)明pvERR與卵黃物質(zhì)的形成有關(guān) .蛻皮激素受體通過(guò)信號(hào)通路調(diào)控卵母細(xì)胞的發(fā)育，控制卵黃蛋白的合成［16～18］.而研究表明，蛻皮激素受體和雌激素受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑非常相似［19～20］，所以推測(cè)pvERR可能也是通過(guò)蛻皮激素受體信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用的.

3.2 pvERR基因在精巢中的表達(dá)

昆蟲(chóng)精子的發(fā)生一般包括三個(gè)階段：第一階段主要在胚胎發(fā)育時(shí)就已經(jīng)完成，指精原干細(xì)胞在遷移到生殖嵴途中及生殖嵴中進(jìn)行多次有絲分裂，精原干細(xì)胞的數(shù)目增加；第二階段指幼蟲(chóng)期的精原干細(xì)胞經(jīng)過(guò)增殖和更新成精原細(xì)胞，精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩次連續(xù)的減數(shù)分裂產(chǎn)生四個(gè)精子細(xì)胞；第三階段是精子形成期，大多數(shù)種類(lèi)在成蟲(chóng)羽化時(shí)已經(jīng)有成熟的精子 .在成熟的擬黑多刺蟻雄蟻精巢，本研究中沒(méi)有觀察到精子發(fā)生早期的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，可能說(shuō)明在變態(tài)為成蟲(chóng)之前精子發(fā)生就已經(jīng)開(kāi)始，生精細(xì)胞發(fā)育的同步性比較高.通過(guò)原位雜交發(fā)現(xiàn)，變形期的精細(xì)胞胞質(zhì)和成熟精子頭部有很強(qiáng)的pvERR mRNA表達(dá)，說(shuō)明pvERR可能參與了精細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控和精子的成熟 .對(duì)東亞飛蝗體外抑制實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素對(duì)于飛蝗精子發(fā)生是必需的，能夠保證產(chǎn)生正常發(fā)育的精細(xì)胞和精子［16］.所以推測(cè)pvERR可能通過(guò)蛻皮激素受體信號(hào)途徑對(duì)精子進(jìn)行調(diào)控.

4 結(jié)論

采用地高辛標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針對(duì)擬黑多刺蟻性腺中pvERR mRNA的表達(dá)進(jìn)行了原位雜交檢測(cè)，結(jié)果顯示：pvERR mRNA在卵子發(fā)生過(guò)程中濾泡細(xì)胞的胞質(zhì)和生長(zhǎng)期、卵黃發(fā)生期的卵母細(xì)胞有表達(dá)，在變形期的精細(xì)胞胞質(zhì)和成熟精子頭部有很強(qiáng)的表達(dá) .在卵子發(fā)生分化階段，pvERR mRNA的陽(yáng)性表達(dá)可能與濾泡細(xì)胞自身的增殖和分化有關(guān) .卵母細(xì)胞生長(zhǎng)階段，濾泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的表達(dá)模式可能說(shuō)明濾泡細(xì)胞給卵母細(xì)胞提供了發(fā)育信息，而卵黃生成期卵母細(xì)胞中pvERR mRNA的表達(dá)可能說(shuō)明pvERR與卵黃物質(zhì)的形成有關(guān) .變形期的精細(xì)胞胞質(zhì)和成熟精子頭部pvERR mRNA的表達(dá)，說(shuō)明pvERR可能參與了精細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控和精子的成熟.

［1］焦園園，葉棋濃，黃翠芬.細(xì)胞膜雌激素受體研究進(jìn)展［J］.腫瘤研究與臨床，2004，16（2）：128-130.

［2］馬蘭，張一娜，李穎.雌激素對(duì)大腦皮質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2004，8（7）：1280-1282.

［3］Giguère V，Yang N，Segui P，et al.Identification of a new class of steroid hormone receptors［J］.Nature，1988，331（6151）：91-94.

［4］Fujimoto J，Nakagawa Y，Toyoki H，et al.Estrogen-related receptor expression in placenta throughout gestation［J］.Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，2005，94（1-3）：67-79.

［5］Bonnelye E，Vanacker J M，Spruyt N，et al.Expression of the estrogen-related receptor 1（ERR-1）orphan receptor during mouse development［J］.Mechanics of Development，1997a，65：71-85.

［6］Giguère V.To ERR in the estrogen pathway［J］.Trends in Endocrinology and Metabolism，2002，13：220-225.

［7］Mitsunaga K，Araki K，Mizusaki H，et al.Loss of PGC-specific expression of the orphan nuclear receptor ERRβresults in reduction of germ cell number in mouse embryos［J］.Mechanics of Development，2004，121（3）：237-246.

［8］Ostberg T，Jacobsson M，Attersand A，et al.A triple mutant of the Drosophila ERR confers ligand-induced suppression of activity［J］.Biochemistry，2003，42（21）：6427-6435.

［9］He H，Xi G，Lu X.2010.Molecular cloning，characterization，and expression analysis of an estrogen receptor-related receptor homologue in the cricket，Teleogryllus emma［J］.Journal of Insect Science，10：188.

［10］郭郛.關(guān)于昆蟲(chóng)的激素控制生殖的一些問(wèn)題［J］.昆蟲(chóng)知識(shí)，1963，1：31-36.

［11］Davey K G.Hormonal controls on reproduction in female hetero［J］.Insect Biochemistry and physiology，1997，35：443-453.

［12］Kozhanova N.Hormonal regulation of gametogenesis in insect［J］.Tsitologiia，2000，42（2）：115-127.

［13］Loeb M J，De Loof A，Gelman D B，Hakim R S，Jaffe H，Kochansky J P et al.Testis ecdysiotropin，an insect gonasotropin that induces synthesis of ecdysteroid［J］.Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2001，47（4）：181-188.

［14］Siga S.Anatomy and functions of brain neurosecretory cells in diptera［J］.Microscopy Research and Technique，2003，62（2）：114-131.

［15］楊佐娟，何建平.昆蟲(chóng)卵子發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展［J］.昆蟲(chóng)知識(shí)，2006，43（4）：447-452.

［16］趙國(guó)秀，奚耕思.神經(jīng)激素對(duì)蝗蟲(chóng)配子發(fā)生的影響［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，32（sup）：60-66.

［17］Carney G E，Bender M.The drosophila ecdysone receptor（EcR）gene is required maternally for normal oogenesis［J］.Genetics，2000，154（3）：1203-1211.

［18］Sun X，Song Q，Barrett B.Effect of ecdysone agonists on vitellogenesis and the expression of EcR and USP in codling moth（Cydia pomonella）［J］.Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2003，52（3）：115-129.

［19］Martinez E，Givel F，Wahli W.A common ancestor DNA motif for invertebrate and vertebrate hormone response elements［J］.The EMBO Journal，1991，10（2）：263-268.

［20］Cherbas L，Lee K，Cherbas P.Identification of ecdysone response elements by analysis of the Drosophila Eip28／29 gene［J］.Genes and Development，1991，5（1）：120-31.