平 玲，魏圓圓，王家敏，沈武玲，馬忠仁，喬自林＊

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030；2.甘肅省 動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州730030）

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的建模分析是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化控制的基礎(chǔ) .通過細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立，不僅有助于理解細(xì)胞的代謝和生理特征，也可以為過程控制和優(yōu)化提供理論基礎(chǔ) .本研究以ST細(xì)胞為研究對(duì)象，在分批培養(yǎng)的方式下，考察ST細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝特征 .在此基礎(chǔ)上，為了更準(zhǔn)確地描述細(xì)胞在培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)代謝及代謝過程，根據(jù)細(xì)胞批培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并分別依據(jù)Logisti方程［1］、Luedeking＆Piret方程［2］及質(zhì)量平衡方程對(duì)細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖消耗及乳酸生成進(jìn)行模擬，建立了細(xì)胞批培養(yǎng)的生長(zhǎng)代謝動(dòng)力學(xué)模型.

1 材料

1.1 細(xì)胞株

ST細(xì)胞（企業(yè)贈(zèng)送）.

1.2 培養(yǎng)基

DMEM（gbico、批號(hào)1129469、USA）；新生牛血清（蘭州民海生物工程有限公司、批號(hào)20110721、China）.

2 方法

2.1 細(xì)胞的批培養(yǎng)

ST細(xì)胞以5.25×104cells／mL接種至T-25的細(xì)胞瓶中，每瓶10mL，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) .每天計(jì)數(shù)、數(shù)據(jù)分析.

2.2 細(xì)胞密度及活力測(cè)定

采用CASY快速細(xì)胞活力分析儀（Roche Applied science，TT-2KA-2206，Germany

進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力分析.

2.3 培養(yǎng)上清中生化指標(biāo)的測(cè)定

采用NOVA400生化分析儀（Nova Biomedical，400，U.S.A）定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的濃度.

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的特征

在T-25的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行批培養(yǎng)，以細(xì)胞密度、細(xì)胞活力、葡萄糖比消耗速率（qGlc）、乳酸的比生產(chǎn)速率（qLac）、乳酸對(duì)葡萄糖的得率指數(shù)（YLac／Glc）為參考指標(biāo)，考察ST細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝特征.

2.5 批培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝動(dòng)力學(xué)模型的建立

依據(jù)細(xì)胞分批培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)、底物消耗及產(chǎn)物形成的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并依?jù)批培養(yǎng)實(shí)際檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立了細(xì)胞批培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)及代謝動(dòng)力學(xué)模型.

2.5.1 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

目前常用Monod和Logistic方程來描述細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué).Monod方程是一種理論的簡(jiǎn)化模型［3］，主要用來描述非抑制性單一底物限制情形下的細(xì)胞生長(zhǎng)，Logistic方程是一個(gè)典型的S型曲線，能較好地放映細(xì)胞分批培養(yǎng)過程中因細(xì)胞密度增加對(duì)細(xì)胞自身生長(zhǎng)的抑制作用且能較好地反映細(xì)胞分批培養(yǎng)的生長(zhǎng)規(guī)律.

在式（1）中，X為細(xì)胞密度，μmax為最大生長(zhǎng)速率，Xmax為細(xì)胞密度生長(zhǎng)上限.

初始條件t＝0時(shí)，細(xì)胞密度X等于細(xì)胞初始密度X0.求解式（1）的方程可得：

2.5.2 產(chǎn)物生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)模型

細(xì)胞代謝產(chǎn)物生成非常復(fù)雜，定性的描述也很多，產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型中較為通用的模型是由Luedeking ＆Piret所提出的數(shù)學(xué)表達(dá)式，把產(chǎn)物生成率看作細(xì)胞生長(zhǎng)率和細(xì)胞生長(zhǎng)量的函數(shù).

其中，P為乳酸濃度，μmax為最大生長(zhǎng)速率；X0為細(xì)胞出事接種密度；Xmax為細(xì)胞密度生長(zhǎng)上限，α、β為常數(shù).

2.5.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

在細(xì)胞批培養(yǎng)的過程中，其消耗主要有3個(gè)方面：一是細(xì)胞生長(zhǎng)的消耗，用以合成新的細(xì)胞；二是細(xì)胞維持基本生命活動(dòng)的消耗；三是用于合成代謝產(chǎn)物的消耗 .因此底物消耗動(dòng)力學(xué)模型可表示為：

初始條件t＝0時(shí)，乳酸濃度P等于接種初始的乳酸濃度P＝0.對(duì)式（4）積分可得：

其中，YX／S為葡萄糖用于細(xì)胞生長(zhǎng)的得率常數(shù)；YP／s為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)；mx為細(xì)胞的維持系數(shù) .將式（3）帶入式（6），整理后可得：

初始條件t＝0時(shí)，葡萄糖濃度S等于初始葡萄糖濃度S0.求解式（7）積分得：

3 結(jié)果與討論

3.1 ST細(xì)胞分批培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)代謝特征

3.1.1 細(xì)胞的生長(zhǎng)

圖1所示ST細(xì)胞批培養(yǎng)過程中的細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)速率 .由圖可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞密度逐漸增加.培養(yǎng)到第2天，細(xì)胞濃度變化不大，至第4天，細(xì)胞濃度變化最大，96h細(xì)胞密度達(dá)到最大，為16.73×105cells／mL，隨后細(xì)胞密度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì) .第6天到第8天密度下降非常快，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞密度為3.67×105cells／mL.培養(yǎng)的前兩天細(xì)胞比生長(zhǎng)速率增加較快，至72h時(shí)細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大，為1.20d-1.隨后細(xì)胞比生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，第5天到第8天下降較快，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞比生長(zhǎng)速率為0.28d-1.在整個(gè)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞維持較高的活率 .細(xì)胞之所以能在很低的葡萄糖濃度下維持生長(zhǎng)，是因?yàn)榧?xì)胞有易化運(yùn)輸和高親和運(yùn)輸兩套系統(tǒng) .當(dāng)葡萄糖濃度較高時(shí)，高親和運(yùn)輸被抑制；當(dāng)葡萄糖濃度較低時(shí)，高親和運(yùn)輸被激活 .故細(xì)胞在培養(yǎng)后期，下降速度較慢，是因?yàn)榧?xì)胞對(duì)葡萄糖的親和性增加［4］，這也為細(xì)胞高效利用葡萄糖創(chuàng)造了條件.

3.1.2 葡萄糖代謝

葡萄糖是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中主要的能源物質(zhì)，同時(shí)還可以通過糖酵解和磷酸戊糖途徑提供生物合成的前體.快速消耗葡萄糖并大量產(chǎn)生乳酸是體外培養(yǎng)細(xì)胞的一個(gè)特點(diǎn) .葡萄糖在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑主要有：①葡萄糖通過磷酸戊糖途徑生成磷酸核糖，用于核酸的生成.②絕大部分葡萄糖通過糖酵解途徑生成乳酸，每摩爾葡萄糖生成2mol ATP（Adenosine triphosphate，三磷酸腺苷）.③有一部分葡萄糖進(jìn)人三羧酸循環(huán)，完全氧化為CO2，每摩爾葡萄糖生成36～38mol ATP.另有少量的葡萄糖用于氨基酸，脂肪酸和其他生物物質(zhì)的合成.

圖1 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)速率

圖2所示為細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的葡萄糖、乳酸濃度的代謝特點(diǎn) .由圖可以看出，培養(yǎng)液的上清中葡萄糖濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸降低，呈現(xiàn)培養(yǎng)的前三天葡萄糖濃度下降較快，至第4天后下降趨勢(shì)緩慢，第8天濃度降到最低為1.19g／L.培養(yǎng)至第2天后，開始有乳酸生成，并且乳酸濃度到第4天增長(zhǎng)較快，之后濃度增加較緩慢，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)濃度最高為1.72g／L.

圖2 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中葡萄糖和乳酸的濃度

圖3為細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中葡萄糖和乳酸的比生長(zhǎng)速率 .由圖可以看出在培養(yǎng)過程中，葡萄糖的比消耗速率總體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，在培養(yǎng)初期葡萄糖的比消耗速率（qGlc）隨著細(xì)胞密度的增加而逐漸增加，培養(yǎng)至72hqGlc達(dá)到最大，為0.074μmol／（106cells·d）.之后隨著細(xì)胞密度的增大，qGlc逐漸下降 .在培養(yǎng)后期由于細(xì)胞密度的下降及細(xì)胞生理特性的改變，qGlc下降較慢 .乳酸比生產(chǎn)速率（qLac）變化總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，到培養(yǎng)的后期出現(xiàn)上升趨勢(shì)，乳酸對(duì)葡萄糖得率系數(shù)（YLac／Glc）分別為4.6 μmol／μmol.

一些研究表明，雜交瘤細(xì)胞系葡萄糖代謝過程中，乳酸的生成存在著切換作用 .最近通過對(duì)這種代謝切換的分子機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖濃度從高變低時(shí)會(huì)引起代謝的變換，切換的結(jié)果是乳酸的產(chǎn)率下降，有時(shí)會(huì)降到零［5，6］.圖2所示在細(xì)胞培養(yǎng)的平臺(tái)期及衰退期由于細(xì)胞密度及培養(yǎng)上清中葡萄糖濃度的逐步下降，細(xì)胞的葡萄糖的消耗基本維持在一個(gè)較低的水平，同時(shí)乳酸也不再產(chǎn)出，培養(yǎng)上清中乳酸累積量呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì) .結(jié)果提示，細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)的后期，可能是由于細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，細(xì)胞的代謝途徑發(fā)生了變化，細(xì)胞同時(shí)消耗葡萄糖及乳酸，用于維持細(xì)胞的活力.

圖3 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中葡萄糖的比消耗速率和乳酸的比生成速率

3.2 細(xì)胞分批培養(yǎng)及代謝動(dòng)力學(xué)模型的建立

在動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)研究中，所用的動(dòng)力學(xué)模型多為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并且大多?shù)只能分段描述 .對(duì)于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)及代謝過程可以較好地模擬，但都不能很好地模擬細(xì)胞生長(zhǎng)的整個(gè)過程 .在分批培養(yǎng)生長(zhǎng)及代謝動(dòng)力學(xué)研究中，根據(jù)ST細(xì)胞分批培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并分別依據(jù)Logistic方程、Luedeking ＆Piret方程及質(zhì)量平衡方程對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)階段的細(xì)胞生長(zhǎng)、乳酸生成及葡萄糖消耗進(jìn)行了模擬 .將式 （2）、（5）、（8）自定義為擬合函數(shù)，根據(jù)實(shí)際測(cè)得的細(xì)胞無血清及有血清分批培養(yǎng)中所測(cè)得的細(xì)胞密度、乳酸生成及葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可分別求得各個(gè)參數(shù)，結(jié)果見表1.

表1 ST細(xì)胞批培養(yǎng)的各參數(shù)

綜上所述，細(xì)胞在批培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)、乳酸生成和葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型方程如下：

4 結(jié)論

細(xì)胞培養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)模型可以分為非結(jié)構(gòu)模型和結(jié)構(gòu)模型兩大類，非結(jié)構(gòu)模型是一種經(jīng)驗(yàn)性模型，來自對(duì)生物過程基本現(xiàn)象的觀察，可用于描述細(xì)胞培養(yǎng)中很多重要的特性，在生物過程的控制和優(yōu)化中經(jīng)常用到 .結(jié)構(gòu)模型是基于細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)及其調(diào)節(jié)機(jī)制，主要包括化學(xué)計(jì)量平衡模型、代謝流模型及控制論模型等.在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，用化學(xué)計(jì)量平衡和代謝流分析的方法研究代謝路徑已經(jīng)開展了多年，并取得了不少成果 .在建立細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝動(dòng)力學(xué)模型時(shí)，需根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和細(xì)胞生長(zhǎng)代謝特性，并經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，不斷修正參數(shù)，從而使模型能更好地反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的內(nèi)在規(guī)律.

本研究由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)獲得模型參數(shù)估計(jì)值，采用Levenberg-Marquardt修正的高斯-牛頓法，以全局性收斂為目標(biāo)，不斷修正模型參數(shù)的初估值，獲得最優(yōu)估計(jì)參數(shù) .結(jié)果表明，細(xì)胞在批培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)、乳酸生成及葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型方程基本反映了細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)葡萄糖消耗及乳酸產(chǎn)出的內(nèi)在規(guī)律 .雖然Logistic方程只涉及到了最大比生長(zhǎng)速率，未能對(duì)整個(gè)培養(yǎng)過程中的比生長(zhǎng)速率的變化規(guī)律進(jìn)行詳盡的描述，但是也比較本質(zhì)地反映了細(xì)胞生長(zhǎng)的快慢 .通過產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型確定的乳酸與細(xì)胞耦聯(lián)參數(shù)α和非耦聯(lián)參數(shù)β，較清晰地反映了細(xì)胞生長(zhǎng)與乳酸產(chǎn)出的關(guān)系 .底物消耗動(dòng)力學(xué)模型所確定的碳源用于細(xì)胞生長(zhǎng)的得率常數(shù)Yx／s和碳源用于乳酸生成的得率常數(shù)Yp／s與細(xì)胞在無血清及有血清條件下生長(zhǎng)的實(shí)際狀況基本吻合.

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