邱寶平+王政+劉曉旭+郭連民+祁林+郭鵬+陳亮+張峻松

摘要：采用響應(yīng)面法（RSM）對(duì)甲酯化試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化， 研究甲酯化條件對(duì)煙草中非揮發(fā)性有機(jī)酸含量測(cè)定的影響。根據(jù)Box-Behnken Design設(shè)計(jì)原理，以非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定量為指標(biāo)，考察了H2SO4-CH3OH溶液體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和料液比等條件對(duì)非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定量的影響。結(jié)果表明，煙草中非揮發(fā)性有機(jī)酸的最優(yōu)試驗(yàn)條件為：H2SO4-CH3OH溶液體積分?jǐn)?shù)為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶43。在最優(yōu)的條件下進(jìn)行了5次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的非揮發(fā)性有機(jī)酸總量平均值為182.32 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%。

關(guān)鍵詞： 煙草；非揮發(fā)性有機(jī)酸；響應(yīng)面法；測(cè)定

中圖分類號(hào)：O657.7+1；S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）15-3629-05

Optimizing the Determination of Non-volatile Organic Acids in Tobacco with

Response Surface Methodology

QIU Bao-ping1，WANG Zheng2，LIU Xiao-xu1，GUO Lian-min1，QI Lin2，GUO Peng1，CHEN Liang1，ZHANG Jun-song2

（1.Hongta Liaoning Tobacco Co.， Ltd.，Shenyang 110002，China；2.Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： To study effects of the determination on non-volatile organic acids in tobacco， response surface methodology（RSM） was used to optimize of the conditions of methylated. Box-Behnken Design was used to design the experiments. The value of non-volatile organic acids was used as a response value. The concentration of H2SO4-CH3OH solution， reaction temperature and time， ratio of liquid to solid were selected as causal factors. The results showed that the best conditions were H2SO4-CH3OH of 12.0%， the temperature of water bath of 92.0 ℃， the time of reflow of 3.0 h， the solid to liquid ratio of 1∶43. Five validation experiments were carried out under these optimal conditions， the average value of total content of non-volatile organic acid was 182.32 mg/g. The relative standard deviation was 0.92%.

Key words： tobacco； non-volatile organic acid； response surface methodology； determination

收稿日期：2013-09-06

作者簡(jiǎn)介：邱寶平（1973—），男，遼寧鐵嶺人，工程師，主要從事卷煙產(chǎn)品配方與質(zhì)量控制研究；通訊作者，張峻松，教授，碩士生導(dǎo)師，

主要從事煙草方面教學(xué)與科研工作，（電話）0371-63670231（電子信箱）13283712413@163.com。

煙草中非揮發(fā)性有機(jī)酸主要包括多元酸和高級(jí)脂肪酸，占煙葉重量的10%左右，可調(diào)節(jié)煙葉自身的酸堿度，影響煙葉的勁頭和吃味，起到平衡煙氣的作用，也能影響煙氣的香氣[1，2]。國(guó)內(nèi)已有關(guān)于酯化試驗(yàn)單因素對(duì)煙草中非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果影響的相關(guān)報(bào)道[3-5]，但未見采用響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)煙草非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定條件。響應(yīng)面法（RSM）根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，分析因素與響應(yīng)值的關(guān)系，達(dá)到優(yōu)化試驗(yàn)條件的目的[6-8]，該方法已廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、食品等領(lǐng)域。本研究以煙草中非揮發(fā)性有機(jī)酸總量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化煙草非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定條件，以期為卷煙工業(yè)的加工利用提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙葉由紅塔遼寧煙草有限責(zé)任公司提供。

硫酸（優(yōu)級(jí)純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；甲醇（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；己二酸二甲酯、草酸二甲酯、丙二酸二甲酯、丁二酸二甲酯、正十三碳酸甲酯、蘋果酸二甲酯、硬脂酸甲酯、正十五碳酸甲酯、月桂酸甲酯、檸檬酸甲酯 （分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯（百靈威科技有限公司）；二氯甲烷、無水硫酸鈉、氯化鈉（分析純，天津德恩化學(xué)試劑有限公司）。

EL204型電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；7820A型氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科學(xué)儀器有限公司）。endprint

1.2 方法

1.2.1 煙葉樣品的制備 按照我國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9]制備煙葉樣品及測(cè)定其含水率。將煙葉用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩后置于棕色廣口瓶中保存，用烘箱法測(cè)定含水率。

1.2.2 H2SO4-CH3OH溶液 在冰水浴攪拌的條件下，將適量濃硫酸緩慢加入一定量的無水甲醇中，攪拌均勻配置成不同體積分?jǐn)?shù)的H2SO4-CH3OH溶液。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液 稱量1.493 1 g己二酸二甲酯于250 mL的容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，即得到濃度為5.972 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液（0 ℃冰箱內(nèi)可保存1個(gè)月）。

1.2.4 煙葉樣品的甲酯化 準(zhǔn)確稱取1.000 0 g樣品，置于100 mL平底燒瓶中，加入一定體積的硫酸-甲醇溶液，再加入1 mL己二酸內(nèi)標(biāo)溶，水浴加熱，取回流液10 mL于125 mL分液漏斗中，加入20 mL飽和氯化鈉溶液，每次用10 mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，加入3.0 g無水硫酸鈉干燥過夜。采用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 氣相色譜分析條件

氣相色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣；柱流速1.2 mL/min （恒流模式）；平均線速度29.134 cm/sec；進(jìn)樣口溫度280 ℃；分流比為5∶1；程序升溫，色譜柱初始溫度50 ℃（保持2 min），以4 ℃/min升溫至220 ℃（保持20 min）；進(jìn)樣量為1.0 μL 。

檢測(cè)器為FID；檢測(cè)器溫度為280 ℃；氫氣為40 mL/min；空氣為450 mL/min；尾吹氣為20 mL/min。

1.4 非揮發(fā)性有機(jī)酸定性、定量方法

與標(biāo)準(zhǔn)樣品相對(duì)保留時(shí)間比較，對(duì)各非揮發(fā)性有機(jī)酸定性，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 工作曲線

稱取適量非揮發(fā)性有機(jī)酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品于50 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制7個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜分析，并對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比與相應(yīng)標(biāo)樣的質(zhì)量進(jìn)行回歸分析。得到各非揮發(fā)性有機(jī)酸甲酯線性方程及相關(guān)系數(shù)，各成分的相關(guān)系數(shù)為0.997～0.999，表明工作曲線線性關(guān)系良好，適用于非揮發(fā)性有機(jī)酸的定量分析。

2.2 甲酯化反應(yīng)的單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同體積分?jǐn)?shù)的H2SO4-CH3OH溶液對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 保持其他因素不變，分別使用2%、4%、6%、8%、10%、12%、15%的H2SO4-CH3OH溶液進(jìn)行考察，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著H2SO4-CH3OH溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，非揮發(fā)性有機(jī)酸總量也增加，當(dāng)濃度達(dá)到10%時(shí)非揮發(fā)性有機(jī)酸總量最大，之后有所下降。主要原因是在高濃度硫酸環(huán)境中，非揮發(fā)性有機(jī)酸會(huì)發(fā)生脫水和氧化反應(yīng)，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。

2.2.2 料液比對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 保持其他因素不變，分別使用25、30、35、40、45、50和55 mL 12%的H2SO4-CH3OH溶液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著H2SO4-CH3OH溶液體積的增加，非揮發(fā)性有機(jī)酸總量測(cè)定值也隨之增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶45時(shí)，非揮發(fā)性有機(jī)酸總量的測(cè)定值最大，所以較合適的料液比為1∶45。

2.2.3 水浴溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 保持其他因素不變，分別取水浴溫度60、70、80、90、100 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著水浴溫度的升高，非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定值也增加，當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí)測(cè)定值接近達(dá)到最大，之后非揮發(fā)性有機(jī)酸的總量有所下降。主要原因是隨著溫度的增加加快了酯化反應(yīng)，但是溫度過高會(huì)導(dǎo)致衍生物揮發(fā)和分解，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低， 選取最佳水溶液溫度為92 ℃。

2.2.4 回流時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 保持其他因素不變，分別選取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。

由圖4所知，隨著回流時(shí)間的增加，非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定值也增加，當(dāng)達(dá)到3 h時(shí)測(cè)定值達(dá)到最大，之后非揮發(fā)性有機(jī)酸的總量有所下降。主要原因是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過長(zhǎng)高級(jí)脂肪酸會(huì)破壞，導(dǎo)致測(cè)定值偏低。

2.2.5 CH2Cl2萃取次數(shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 保持其他因素不變，對(duì)回流液用CH2Cl2萃取1、2、3、4、5、6次，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著萃取次數(shù)的增加，非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定值也增加，甲酯化衍生物得到充分萃取，當(dāng)萃取5次時(shí)測(cè)定值最大，之后非揮發(fā)性有機(jī)酸的總量有所下降。因此以下試驗(yàn)使用CH2Cl2萃取5次。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以A-H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)、B-料液比、C-水浴溫度、D-回流時(shí)間為考察因素，采用Design-Expert軟件為輔助手段設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面各因素及水平如表1所示，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行了29組試驗(yàn)。

2.3.2 方差分析和二元回歸方程擬合 采用Design-Expert軟件對(duì)29組試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定值的編碼自變量A、B、C、D的二次多項(xiàng)式回歸方程：R=196.87+2.81A+2.18B+2.83C+3.21D+0.21AB-0.44AC-0.23AD+0.17BC+0.45BD-4.85CD-1.30A2-8.46B2-5.04C2-2.51D2

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

由表2可知，模型F值為4.33，概率P<0.05，表示該模型是顯著的，非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定值與所選因素之間存在顯著相關(guān)性，回歸模型的決定系數(shù)（R2=0.812 3）即由這4個(gè)因素及其二次項(xiàng)決定， 而失擬項(xiàng)F值為0.77，概率P>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，表示回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合情況良好。4個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響大小順序?yàn)椋夯亓鲿r(shí)間>水浴溫度>H2SO4-CH3OH溶液體積分?jǐn)?shù)>料液比?；貧w模型中A2、B2、C2對(duì)非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定值影響是顯著的（P<0.05）。endprint

2.3.3 交互作用分析 對(duì)影響因素的響應(yīng)面圖和等高線圖進(jìn)行分析，更直觀的表現(xiàn)兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定值的影響。如圖6至圖8。

由圖6、圖8可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的濃度和料液比）、BD（料液比和回流時(shí)間）、CD（水浴溫度和回流時(shí)間）的等高線圖成橢圓形，表明交互作用對(duì)響應(yīng)值有影響[10]。由圖6、圖7可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)和料液比）、BD（料液比和回流時(shí)間）的交互作用不明顯。

對(duì)模型響應(yīng)面規(guī)范分析，結(jié)合試驗(yàn)的可操作性，得到非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定的最優(yōu)條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶43。

2.3.4 最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行5次試驗(yàn)，非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定值平均值為182.32 mg/g，試驗(yàn)方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%。因此，利用響應(yīng)面分析法得到非揮發(fā)性有機(jī)酸的最佳測(cè)定工藝條件是真實(shí)可靠的。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面回歸分析法，對(duì)測(cè)定非揮發(fā)性有機(jī)酸的試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。以非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定值為指標(biāo)，對(duì)二次多遠(yuǎn)回歸模型的方差分析，考察了H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)、料液比、水浴溫度、回流時(shí)間等試驗(yàn)條件對(duì)非揮發(fā)性有機(jī)酸總量測(cè)定值的影響。

對(duì)模型響應(yīng)面規(guī)范分析，結(jié)合試驗(yàn)的可操作性，得到非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定的最優(yōu)條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶43。

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[11] 王 濤， 賀 帆， 田斌強(qiáng)， 等. 烤煙煙葉淀粉的提取工藝優(yōu)化[J]. 煙草科技， 2012 （6）： 80-83.endprint

2.3.3 交互作用分析 對(duì)影響因素的響應(yīng)面圖和等高線圖進(jìn)行分析，更直觀的表現(xiàn)兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定值的影響。如圖6至圖8。

由圖6、圖8可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的濃度和料液比）、BD（料液比和回流時(shí)間）、CD（水浴溫度和回流時(shí)間）的等高線圖成橢圓形，表明交互作用對(duì)響應(yīng)值有影響[10]。由圖6、圖7可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)和料液比）、BD（料液比和回流時(shí)間）的交互作用不明顯。

對(duì)模型響應(yīng)面規(guī)范分析，結(jié)合試驗(yàn)的可操作性，得到非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定的最優(yōu)條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶43。

2.3.4 最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行5次試驗(yàn)，非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定值平均值為182.32 mg/g，試驗(yàn)方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%。因此，利用響應(yīng)面分析法得到非揮發(fā)性有機(jī)酸的最佳測(cè)定工藝條件是真實(shí)可靠的。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面回歸分析法，對(duì)測(cè)定非揮發(fā)性有機(jī)酸的試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。以非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定值為指標(biāo)，對(duì)二次多遠(yuǎn)回歸模型的方差分析，考察了H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)、料液比、水浴溫度、回流時(shí)間等試驗(yàn)條件對(duì)非揮發(fā)性有機(jī)酸總量測(cè)定值的影響。

對(duì)模型響應(yīng)面規(guī)范分析，結(jié)合試驗(yàn)的可操作性，得到非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定的最優(yōu)條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶43。

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2.3.3 交互作用分析 對(duì)影響因素的響應(yīng)面圖和等高線圖進(jìn)行分析，更直觀的表現(xiàn)兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定值的影響。如圖6至圖8。

由圖6、圖8可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的濃度和料液比）、BD（料液比和回流時(shí)間）、CD（水浴溫度和回流時(shí)間）的等高線圖成橢圓形，表明交互作用對(duì)響應(yīng)值有影響[10]。由圖6、圖7可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)和料液比）、BD（料液比和回流時(shí)間）的交互作用不明顯。

對(duì)模型響應(yīng)面規(guī)范分析，結(jié)合試驗(yàn)的可操作性，得到非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定的最優(yōu)條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶43。

2.3.4 最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行5次試驗(yàn)，非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定值平均值為182.32 mg/g，試驗(yàn)方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%。因此，利用響應(yīng)面分析法得到非揮發(fā)性有機(jī)酸的最佳測(cè)定工藝條件是真實(shí)可靠的。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面回歸分析法，對(duì)測(cè)定非揮發(fā)性有機(jī)酸的試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。以非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定值為指標(biāo)，對(duì)二次多遠(yuǎn)回歸模型的方差分析，考察了H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)、料液比、水浴溫度、回流時(shí)間等試驗(yàn)條件對(duì)非揮發(fā)性有機(jī)酸總量測(cè)定值的影響。

對(duì)模型響應(yīng)面規(guī)范分析，結(jié)合試驗(yàn)的可操作性，得到非揮發(fā)性有機(jī)酸測(cè)定的最優(yōu)條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分?jǐn)?shù)為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶43。

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