羅 強(qiáng)，恒春娜，段世華,2,3

山茶屬（L.）植物葉片基因組DNA不同提取方法的比較

羅 強(qiáng)1，恒春娜1，*段世華1,2,3

（1. 井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安 343009；2. 井岡山大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源研究所，江西，吉安 343009； 3. 江西省生物多樣性與生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西，吉安 343009）

山茶屬植物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為了獲得高質(zhì)量的山茶屬植物葉片基因組總DNA，分別采用改良的CTAB法和改良的SDS法提取山茶屬植物葉片中基因組DNA。結(jié)果顯示，CTAB 法提取的DNA 產(chǎn)率、純度均高于SDS 法，且雜質(zhì)少，無(wú)明顯降解。研究結(jié)果表明，改良的CTAB法比SDS法更適合用于山茶屬植物葉片基因組總DNA的提取。

山茶屬；DNA提取；SDS；CTAB

獲得高質(zhì)量的植物基因組總DNA是開(kāi)展植物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。不同植物體由于細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分存在很大的差異，甚至相同植物的不同部位DNA提取的策略可能不同[1]，因此針對(duì)特殊類群的植物或植物的特殊部位應(yīng)該要有專門(mén)的DNA提取方法。目前，植物基因組總DNA提取的方法有很多種，如堿裂解法、SDS 法、CTAB法、試劑盒法等，其中SDS法和CTAB法是兩種最為常用也相對(duì)經(jīng)濟(jì)的方法。SDS法由Dellaporta等在1983年首先建立[2]，后經(jīng)過(guò)許多學(xué)者的改進(jìn)用于植物基因組DNA的提取[1,3]。CTAB法由Murray等在1980年首先使用[4]，在除去DNA中的多糖物質(zhì)方面效果良好。之后，Doyle在1987年建立了該DNA提取方法的完整體系并對(duì)其進(jìn)行了多次改良[5]，De la Cruz等(1997)和譚曉風(fēng)等(1999)對(duì)此方法也分別進(jìn)行了改良[6-7]。近幾年，隨著DNA提取技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展，多種用于DNA提取的試劑盒得到了開(kāi)發(fā)，由于其方便快捷的優(yōu)點(diǎn)而的到了廣泛的使用，但由于其價(jià)格相對(duì)昂貴，特別是提取DNA的量比較少，因此，在DNA需求量比較大的研究中，比如Southern Blotting，該方法則受到了一定的制約。

山茶屬（L.）植物隸屬于山茶科（Theaceae），是山茶科植物中最大的一個(gè)屬，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。由于山茶屬植物代謝物比較多，獲得純度較高的基因組總DNA比較困難，不同研究者采用的提取方法存在一定的差異，提取DNA的質(zhì)量也不盡相同[7-9]。本研究利用兩種不同方法對(duì)山茶屬植物基因組總DNA進(jìn)行提取和比較分析，目的是為了探索一種山茶屬植物最佳的總DNA抽提方法，為進(jìn)一步開(kāi)展山茶屬植物在DNA水平上的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究共選取了山茶屬植物三個(gè)物種（油茶（Abel）、云南紅山茶Coh. Stuart）和茶梅（Thunb.））的各兩份材料的幼嫩葉片用于基因組DNA 的提取，材料編號(hào)與來(lái)源信息參見(jiàn)表1。所有植物材料的葉片均采自井岡山大學(xué)校園內(nèi)，保存于-80℃超低溫冰箱備用。

表1 本研究使用的山茶屬植物材料

1.1.2 儀器設(shè)備與試劑

本實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器：高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）、超低溫冰箱（日本三洋）、蛋白核酸測(cè)定儀（德國(guó)eppendorf公司）、凝膠成像系統(tǒng)（YIN—2000，北京亞力恩機(jī)電技術(shù)研究所）等。

所有化學(xué)試劑和藥品均購(gòu)自相關(guān)生物技術(shù)公司，主要溶液的配置方法如下：

①CTAB提取緩沖液：2 %CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20 mmol/L EDTA，pH8.0，1.4 mmol/L NaCl，2% PVP；②SDS提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，50 mmol/L EDTA，pH8.0，500 mmol/L NaCl，1.5 %SDS，2% PVP；③TE緩沖液：10 mmol/L Tris- HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0；④10 %CTAB緩沖液：10 %CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20 mmol/L EDTA，pH8.0，1.4 mmol/L NaCl；⑤1 ×TAE電泳緩沖液：40 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，2 mmol/L EDTA，pH8.0，20 mmol/L Acetic acid。

1.2 基因組總DNA提取方法

1.2.1 CTAB法[10]

參照Doyle(1990)的方法并通過(guò)改良進(jìn)行，具體步驟如下：

①稱取植物葉片材料約1 g于研缽中，加入液氮研磨至粉末狀后，迅即轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，加入5 mL65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，每1 mL提取緩沖液加入20 μL 2--巰基乙醇（使終濃度為2 %（V/V）），65℃水浴90 min，期間每隔10 min 搖動(dòng)1次，使提取液與樣品充分混合。②將溫浴的材料取出置于室溫下，待冷卻至室溫后加入5 mL氯仿-異戊醇（體積比為24:1），輕柔反復(fù)顛倒至充分混勻后，置搖床上輕緩搖勻30 min，6000 rpm，離心10 min。③將上清液轉(zhuǎn)移至一新的15 mL離心管中，加入1/10體積65 ℃預(yù)熱的10%CTAB緩沖液，輕搖混勻后，加入5 mL氯仿-異戊醇（體積比為24:1）輕搖混勻，6000 rpm，離心10 min。此步驟可重復(fù)1~2次。④加入1/10體積3M NaAc溶液，輕搖混勻后，加入等體積預(yù)冷（-20 ℃）的異丙醇，輕搖至絮狀物出現(xiàn)，置-20 ℃冰箱1 h。6000 rpm，離心10 min，棄上清液。⑤用2 mL75%和無(wú)水乙醇各洗2次，然后將離心管放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中干燥DNA。⑥待DNA干燥后，加入400 μLTE緩沖液和5 μL RNase A于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中消化RNA 2 h，置4℃冰箱1 d，然后保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 SDS法[11]

依照Edwards等（1991）的方法并做改良，具體步驟如下：

①稱取植物葉片材料約1 g于研缽中，加入液氮研磨至粉末狀后，迅速轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，加入5 mL65 ℃預(yù)熱的SDS提取緩沖液，每1 mL提取緩沖液加入20 μL 2--巰基乙醇（使終濃度為2%（V/V）），65 ℃水浴30 min，期間每隔5 min 搖動(dòng)一次，使提取液與樣品充分混合。②加入1/10體積5 M KAc溶液后，劇烈震蕩，冰浴20 min。③6000 rpm離心10 min 將上清液轉(zhuǎn)移至一新的15 mL離心管中，加入5 mL氯仿-異戊醇(體積比為24:1)，輕柔反復(fù)顛倒至充分混勻后，置搖床上輕緩搖勻10 min，6000 rpm，離心10 min。重復(fù)此步驟1~2次。④將上清液轉(zhuǎn)移至一新的15 mL離心管中，加入0.7體積預(yù)冷（-20 ℃）的異丙醇， -20 ℃冰箱沉降1 h。6000 rpm，離心10 min，棄上清液。⑤用2 mL70 %和無(wú)水乙醇各洗DNA沉淀2次。⑥待DNA干燥后，加入400 μL TE緩沖液和5 μL RNase A于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置2 h后，然后保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 DNA樣品的檢測(cè)方法

對(duì)所提取的DNA樣品，分別采用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法，檢測(cè)其得率和質(zhì)量。

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

取2.0 μL總DNA 樣品與3 μL ddH2O和1 μL 6 × Loading buffer混勻。用0.8 %瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)進(jìn)行電泳，電壓5 V/cm。電泳后用YIN—2000凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)和照相。

1.3.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)

提取的基因組總DNA樣品用eppendorf公司的蛋白核酸測(cè)定儀進(jìn)行定量測(cè)定。取2 μL DNA樣品置于比色皿中加入98 μL ddH2O，測(cè)定DNA溶液分別在260 nm、280 nm處的吸光值，記錄A260、A280及A260與A280的比值（A260/A280）。通過(guò)A260值來(lái)計(jì)算DNA濃度，即濃度= 50 ng/μL × A260× 稀釋倍數(shù)，通過(guò)A260/A280值計(jì)算DNA純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA 的電泳檢測(cè)結(jié)果

兩種方法所提取的山茶屬植物基因組總DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。電泳結(jié)果顯示，不同樣品總DNA得率存在一定的差異，分析造成這種結(jié)果的可能原因是在進(jìn)行液氮磨樣時(shí)，樣品的濺灑造成樣品實(shí)際量的差異以及在DNA提取過(guò)程中的一些操作誤差所致。電泳結(jié)果也顯示SDS法提取的總DNA效果較差，除了樣本HSC1能隱約看見(jiàn)DNA條帶外，其余樣品均未能看見(jiàn)總DNA電泳條帶。

圖1 兩種不同提取方法所得山茶屬植物基因組總DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 植物基因組總DNA 的紫外分光光度法檢測(cè)結(jié)果

光吸收比值A(chǔ)260/A280是衡量DNA純度的一個(gè)重要指標(biāo)。在兩種不同的總DNA提取方法中，SDS法所提取的總DNA的A260/A280值均比較低，介于1.11~1.60之間，其中只有樣品YC1相對(duì)接近1.80。CTAB法提取的總DNA的A260/A280值均較好的接近于1.80，它們的值介于1.68~1.89之間（表2）。在總DNA得率上，CTAB法得率普遍高于SDS法，SDS法除了樣品HSC1的得率較高外，其它樣品總DNA的得率均較低（見(jiàn)表2）。分光光度計(jì)檢測(cè)的結(jié)果與電泳檢測(cè)的結(jié)果一致。

表2 兩種不同方法提取植物總DNA的得率和純度比較

3 討論

純度好的雙鏈DNA其A260/A280值應(yīng)該為1.8，提取得到DNA的A260/A280值如果在1.8左右均可認(rèn)為是純度比較高，質(zhì)量比較好的DNA。如果含有一定量RNA、蛋白質(zhì)、多糖、多酚和單寧類等雜質(zhì)的總DNA，其A260/A280值一般會(huì)高于2.0或低于1.7。本研究所采用的兩種植物基因組總DNA提取方法中，SDS法所得DNA樣品的A260/A280均低于1.7，變化范圍在1.11~1.60之間，表明SDS法提取的DNA含有較多的雜質(zhì)，純度較低。而CTAB法提取的總DNA的A260/A280值均在1.8左右，變法范圍在1.68~1.89之間，表明CTAB法能有效地除去DNA中的大部分雜質(zhì)，如多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，所提取的DNA雜質(zhì)少，純度較高。因此，研究結(jié)果表明改良的CTAB法是一種用于提取山茶屬植物基因組總DNA較理想的方法。

木本植物葉片往往含有大量的酚類和醌類等次生代謝物，許多研究表明，常規(guī)的CTAB和SDS提取法很難將這些雜質(zhì)去除[7-9, 12]。早期筆者曾試圖采用常規(guī)CTAB法和SDS法提取杜鵑屬葉片基因組總DNA，但均未能獲得成功。PVP（聚乙烯聚吡咯烷酮）對(duì)多酚類和多醌類物質(zhì)具有很好的吸附和去氧化作用。通過(guò)在CTAB提取液中加入2%的PVP，對(duì)常規(guī)CTAB法進(jìn)行改良，結(jié)果能很好地去除植物DNA樣本中的多酚類和多醌類物質(zhì)[9, 12-13]。本研究表明，改良的CTAB法能獲得質(zhì)量較好的山茶屬植物基因組DNA，然而加入2%PVP改良的SDS法依然不能對(duì)山茶屬植物DNA進(jìn)行有效提取，其原因有待于進(jìn)一步探討。

DNA產(chǎn)率是衡量一種DNA提取方法優(yōu)劣的重要參數(shù)之一。本研究所采用的兩種植物總DNA提取方法，通過(guò)紫外分光光度法測(cè)得的總DNA產(chǎn)率，CTAB法較SDS法要高。然而在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果中，SDS法除了樣品HSC1可見(jiàn)DNA條帶外，其它樣品均未見(jiàn)到DNA電泳帶，這與紫外分光光度法檢測(cè)到的結(jié)果并不能很好的吻合。劉杰等（2011）在對(duì)紅豆杉屬植物總DNA提取方法的比較研究中認(rèn)為，較多的雜質(zhì)會(huì)影響DNA的A260值，從而影響依據(jù)此值計(jì)算出的DNA產(chǎn)率，因此，通過(guò)紫外分光光度法測(cè)得的結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果不能很好的相互印證。在這種情況下利用光吸收值計(jì)算出的DNA產(chǎn)率不能反應(yīng)DNA的真實(shí)濃度和產(chǎn)率，凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)的結(jié)果更為可靠些[12]。

[1] Matasyoh L G, Wachira F N, Kinyua M G, et al. Leaf storage conditions and genomic DNA isolation efficiency in Ocimum gratissimum from Kenya[J]. African Journal of Biotechnology, 2008, 7(5): 557-564.

[2] Dellaporta S L, Wood J, Hicks J B. A plant DNA minipreparation: version II[J]. Plant molecular biology reporter, 1983, 1(4): 19-21.

[3] Guillemaut P, Maréchal-Drouard L. Isolation of plant DNA: A fast, inexpensive, and reliable method[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1992, 10(1): 60-65.

[4] Doyle J J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem bull, 1987, 19: 11-15.

[5] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic acids research, 1980, 8(19): 4321-4326.

[6] De la Cruz M, Ramirez F, Hernandez H. DNA isolation and amplification from cacti[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1997, 15(4): 319-325.

[7] 譚曉風(fēng), 漆龍霖, 黃曉光, 等. 山茶屬植物葉片DNA抽提[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報(bào), 1999, 19(4): 75-77.

[8] 倪穗, 田敏, 李紀(jì)元. 紅山茶高質(zhì)量基因組DNA的提取[J]. 寧波大學(xué)學(xué)報(bào):理工版, 2007, 20(2): 163-167.

[9] 劉嬋, 王博, 段青, 等. 滇山茶基因組DNA不同提取方法效果比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(6):49-50.

[10] Doyle J J. Isolation of plant DNA from fresh tissue[J]. Focus, 1990, 12: 13-15.

[11] Edwards K, Johnstone C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis[J]. Nucleic acids research, 1991, 19(6): 1349.

[12] 劉杰, 高連明. 紅豆杉屬植物三種不同DNA提取方法的分析比較[J]. 廣西植物, 2011, 31(2): 244-249.

[13],, 胡乃鳳, 等. 基于ISSR指紋標(biāo)記的亞洲栽培稻與野生稻遺傳多樣性分析[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2010, 31(1): 118-124.

Comparison of different extraction methods of genomic DNA from leaf tissues ofL.

LUO Qiang1, HENG Chun-na1,*DUAN Shi-hua1,2,3

(1. School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2. Institute of Eco-Environment and Resources, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 3. Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering of Jiangxi Province, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

The plants ofL. have very important economic values. In order to obtain high quality genomic DNA from leaf tissues ofL., two genomic DNA extraction methods (modified CTAB method and modified SDS method) were compared in this study, respectively. The data showed that DNA yield and purity for modified CTAB method was higher than that for modified SDS method, and the DNA samples for the modified CTAB method has less impurity and degradation. The results of this study indicated that the modified CTAB method is more suitable for genomic DNA extraction than modified SDS method from the leaf tissues ofL.

L.; DNA extraction; SDS; CTAB

Q781

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.04.009

1674-8085(2014)04-0040-04

2014-04-09；

2014-05-11

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009GZN0071)；江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ12464)；井岡山大學(xué)科研基金項(xiàng)目

羅 強(qiáng)(1990-)，男，江西南康人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail: 453921137@qq.com);

恒春娜(1990-)，女，云南福貢人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail:hchn1990524@qq.com);

*段世華(1968-)，男，江西永新人，教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究(E-mail:shihua_duan@aliyun.com).