張宇燕，賀根和，陸麗君，劉 佳，黃翔峰，梁亮亮

好氧反硝化菌的篩選鑒定及其脫氮特性研究

張宇燕1，賀根和2，陸麗君1，劉 佳1，*黃翔峰1，梁亮亮2

(1.同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092; 2.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 吉安 343009）

通過分離篩選獲得3株好氧反硝化菌S1、S2和S3，初步鑒定S1為土生拉烏爾菌屬（），S2和S3均為解鳥氨酸拉烏爾菌屬（）。這3株菌為好氧反硝化菌屬首次報道，對其好氧反硝化脫氮特性的研究結(jié)果表明，培養(yǎng)液中氮含量的大幅變化均發(fā)生于菌株的對數(shù)生長期；在以硝酸鹽或亞硝酸鹽為唯一氮源的研究中，NO3--N和NO2--N的24 h去除率分別約為26%和67%，說明這3株菌更容易利用亞硝酸鹽進(jìn)行好氧反硝化；而且研究結(jié)果還表明，S3為脫氮效率最優(yōu)的菌株，對低氮濃度的富營養(yǎng)化水質(zhì)有較好的反硝化效果，4 h時S3的反硝化速率最大，達(dá)0.62 mg·L-1·h-1，對TN的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率可達(dá)52.5%。

好氧反硝化菌；篩選鑒定；富營養(yǎng)化；脫氮特性

隨著人口分布的集中和工農(nóng)漁林業(yè)的發(fā)展，水體富營養(yǎng)化問題日益加劇，嚴(yán)重危及水生態(tài)系統(tǒng)和人類的健康，而氮素過剩是導(dǎo)致該類污染的主要原因之一。目前使用比較廣泛的生物脫氮工藝均涉及好氧硝化和缺氧硝化兩個環(huán)節(jié)。其中，反硝化反應(yīng)是缺氧狀態(tài)下，反硝化菌利用硝態(tài)氮中的氧作為電子受體，將硝態(tài)氮還原成氣態(tài)氮的過程。

封閉或半封閉的景觀水體通常面臨硝態(tài)氮過度積累致污的風(fēng)險，同時伴有由于水體高溶氧傳統(tǒng)反硝化作用失效的問題，這種狀況受到越來越多研究者的關(guān)注。20世紀(jì)80年代至今，利用硝酸鹽和O2共同作為受體的好氧反硝化菌株的研發(fā)解決了這一難題[1]，也彌補了傳統(tǒng)生物脫氮工藝中分區(qū)給氧等缺陷，國內(nèi)外已報道的有假單胞菌屬[2]、沙門氏菌屬[2]、蠟樣芽孢桿菌屬[2]、糞產(chǎn)堿菌屬[3]、克雷伯氏菌屬[4]、海洋菌屬[5]、堿桿菌屬[6]等。

本研究對分離篩選獲得的具有較強好氧反硝化能力的菌株進(jìn)行分類學(xué)鑒定，在比較研究各菌株好氧反硝化特性的基礎(chǔ)上，對其應(yīng)用于低氮濃度的模擬富營養(yǎng)化景觀水體水質(zhì)的脫氮效果及TN脫除途徑作一初步探討。

1 材料與方法

1.1 菌源

江西省吉安市某生活污水處理廠二級生物處理系統(tǒng)中的活性污泥。

1.2 培養(yǎng)基

選擇性富集培養(yǎng)基[1, 7](g·L-1)：酒石酸鉀鈉 20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，微量元素溶液2 mL，pH=7.2。LB培養(yǎng)基(g·L-1)：胰化蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH=7.0。反硝化培養(yǎng)基[4](g·L-1)：NaCl 4，Na2HPO4·12H2O 21.5，KH2PO40.9，微量元素溶液30 mL，pH=8.0，碳源（葡萄糖）和氮源（NaNO3或NaNO2）的添加量根據(jù)試驗需要進(jìn)行調(diào)整；以NaNO3和NaNO2為唯一氮源的培養(yǎng)基分別記為DM1和DM2。模擬富營養(yǎng)化水質(zhì)(g·L-1)：C6H12O60.5，KNO30.058，KCl 0.063，MgSO40.023，無水CaCl20.023，NaHCO30.065，KH2PO40.023，微量元素溶液2 mL，pH=7.2。

1.3 好氧反硝化菌株的篩選

1.3.1 菌株的富集馴化初篩

將5 g污泥樣品加入到盛有玻璃珠的100 mL無菌水中，充分混勻后按1%比例接種于選擇性富集培養(yǎng)基中，在30 ℃震蕩培養(yǎng)箱以轉(zhuǎn)速200 r·min-1培養(yǎng)2個周期，每個周期為2 d。富集培養(yǎng)結(jié)束后，將富集培養(yǎng)基內(nèi)的KNO3含量提高至2.0 g·L-1，進(jìn)行2個周期的馴化培養(yǎng)，其他條件同富集培養(yǎng)。馴化培養(yǎng)后，采用稀釋涂布法、連續(xù)劃線法分離單菌落。

1.3.2 菌株的復(fù)篩

在盛有10 mL反硝化培養(yǎng)基DM1的小試管（內(nèi)倒置杜氏小管）中接菌，靜置培養(yǎng)2 d后，觀察杜氏小管中的氣泡產(chǎn)生情況，將產(chǎn)氣量較大的菌株分別接種于LB培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)（30 ℃，200 r·min-1）16 h，離心收集菌體，然后將經(jīng)無菌水洗滌3次后相等濕重的菌體分別加入盛有DM1的三角瓶中，采用相同的搖床條件培養(yǎng)(DO > 5 mg·L-1)，以未接種的DM1作為對照，于設(shè)定的時間取樣，測定NO3－-N，挑選對NO3－-N去除率較高的菌株進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 好氧反硝化菌株的脫氮性能檢測及分析

1.4.1 好氧反硝化特性研究

將上述篩選獲得的單菌株活化16 h，反復(fù)離心洗滌3次后，取0.33 g濕菌體稀釋10倍，再將1%菌液分別加入DM1和DM2培養(yǎng)基中，采用與1.3.2相同的搖床培養(yǎng)條件，分別以未接種的DM1和DM2作為對照，于設(shè)定的時間取樣，通過測定OD600、NO3－-N和NO2－-N，對比研究分別以硝酸鹽、亞硝酸鹽為氮源時的好氧反硝化特性。其中，DM1、DM2中氮的含量分別約38 mg·L-1和27 mg·L-1，以葡萄糖為碳源使得C/N值約為12。

1.4.2 菌株對富營養(yǎng)化水質(zhì)的反硝化效果測試

將篩選所得菌株接種于氮含量約8 mg·L-1的模擬富營養(yǎng)化水中，在與1.3.2相同的搖床條件下培養(yǎng)，于設(shè)定的時間取樣，分別測定離心和不離心時水中的TN濃度，研究菌株對TN的脫除效果。

1.4.3 菌株對富營養(yǎng)化水質(zhì)的反硝化脫氮效果分析

水體中的含氮物質(zhì)經(jīng)脫氮菌處理后，減少的氮一部分被脫氮菌脫除，轉(zhuǎn)化為氣體，排放到大氣中，即胞外還原反硝化途徑；另一部分被同化為微生物細(xì)胞的組成成分，即胞內(nèi)同化途徑。

分別通過公式1、2和3計算菌株的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率、同化脫氮貢獻(xiàn)率及反硝化速率，對1.4.2中的TN脫除效果及途徑進(jìn)行具體分析。

R1=CM/C (式1)

R2=(C-CM)/C (式2)

=CM/T (式3)

R1-反硝化脫氮貢獻(xiàn)率(%)；R2-同化脫氮貢獻(xiàn)率(%)；-反硝化速率(mg·L-1·h-1)；CM-處理時間段內(nèi)TN的削減量（含微生物細(xì)胞）(mg·L-1)；C-處理時間段內(nèi)TN的削減量(mg·L-1) ；T-處理時間 (h)。

1.5 好氧反硝化菌株的系統(tǒng)分類學(xué)鑒定

采用16 S rDNA 基因序列分析，對好氧反硝化菌株的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴增。PCR擴增引物為27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3')和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應(yīng)體系為（25 μL）：2.5 μL 10 × PCR buffer( Mg2+plus），2 μL dNTPs（2.5 mM），各0.3 μL正、反向引物(10 μM)，0.2~0.5 μL DNA模板，0.2 μLDNA聚合酶(5 U/μL)，其余體積以無菌水補足。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，31個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將菌株的16S rDNA PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離并用瓊脂糖凝膠分離純化試劑盒進(jìn)行純化。通過TA克隆技術(shù)將純化后的16 S rDNA片段轉(zhuǎn)化到DH5α中，氨芐青霉素及藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆子送上海生工進(jìn)行序列測定。將得到的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行BLAST同源性比對及分析之后，利用MEGA5.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 指標(biāo)分析方法

菌體生長（OD600）測定采用濁度法；NO3－-N、NO2－-N和TN的濃度測定分別采用紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法和過硫酸鉀氧化紫外分光光度法。

2 結(jié)果與分析

2.1 好氧反硝化菌株的篩選

經(jīng)富集馴化、分離純化，初步篩選到12株細(xì)菌。通過杜氏小管反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，小管中產(chǎn)生氣泡的有9株，其中產(chǎn)氣量較大的有5株，然后對這5株菌采用搖床培養(yǎng)試驗進(jìn)行復(fù)篩。篩選結(jié)果表明，產(chǎn)氣量較大并且NO3－-N去除率達(dá)到25%以上的菌有3株，分別記為S1、S2和S3，對這3株菌保種后用于好氧反硝化特性的研究。

2.2 菌株的好氧反硝化特性

分別采用DM1和DM2反硝化培養(yǎng)基，即分別以硝酸鹽（0=38 mg·L-1）、亞硝酸鹽（0=27 mg·L-1）為唯一氮源，C/N=12，研究菌株S1、S2和S3的反硝化規(guī)律，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，分別以硝酸鹽或亞硝酸鹽為唯一氮源時，S1、S2和S3這3株菌的600分別于10 h和20 h達(dá)最大值，之后開始趨于穩(wěn)定，在不同氮源的培養(yǎng)基中同一菌株的生長曲線不同；在3株菌的對數(shù)生長期內(nèi)，NO3--N和NO2--N濃度下降均最為明顯,NO3--N和NO2--N的24 h去除率分別約為26%和67%，以同種氮源培養(yǎng)的菌株間脫氮率無太大差異；以硝酸鹽為唯一氮源時，這3株菌在各自對數(shù)生長期內(nèi)均產(chǎn)生NO2--N的積累，但積累量差別很大，其中菌株S3的NO2--N積累量最小，僅有0.109 mg·L-1，并且最快得到完全脫除，所以認(rèn)為好氧反硝化菌S3為最優(yōu)菌株。

圖1 3株菌分別以NO3--N或NO2--N為唯一氮源的反硝化規(guī)律

2.3 菌株對富營養(yǎng)化水質(zhì)的反硝化脫氮效果

采用模擬富營養(yǎng)化水質(zhì)培養(yǎng)，即以硝酸鹽（0=8 mg·L-1）為唯一氮源，研究菌株S1、S2和S3的TN脫除規(guī)律，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，S1、S2和S3這3株菌的OD600于8 h達(dá)最大值，之后開始趨于穩(wěn)定；TN含量變化呈下降趨勢，尤其在菌的對數(shù)生長期內(nèi)TN濃度下降較為明顯，8 h后幾乎沒有變化，其中8 h時離心菌體測得TN濃度接近0 mg·L-1，說明培養(yǎng)液中的TN此時已被菌體全部用于同化和反硝化，而8 h后不離心菌體測得TN濃度幾乎不變，說明反硝化脫氮作用幾乎停止，由于8 h時培養(yǎng)液中的TN被完全利用，所以之后反硝化作用也達(dá)到了最大化；在不離心和離心菌體的情況下，各時間段內(nèi)S3的TN去除率均最大，其中8 h時分別可達(dá)32.4%和91.4%，說明S3對TN的脫除效果最好。

圖2 三株菌的TN脫除規(guī)律

2.4 菌株對富營養(yǎng)化水質(zhì)的反硝化脫氮效果分析

由圖2所示菌株的TN脫除規(guī)律可知，0~4 h，不離心時各菌株對TN的削減量(以CM表示)分別為0.03、1.11和2.49 mg·L-1，而離心時對TN的削減量（以C表示）分別為2.06、4.18和4.74 mg·L-1，同理計算出各菌株其它時間段內(nèi)對TN的削減量如圖3所示，由于8 h后TN濃度幾乎不變，所以12 h時的各菌株對TN的削減量與8 h時的相差不多。

圖3 三株菌的TN削減量

由圖3結(jié)合公式1、2計算可知各菌株各時間段內(nèi)對TN的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率R1和同化脫氮貢獻(xiàn)率R2，結(jié)果如圖4所示。4 h時，三株菌對TN的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率分別為1.5%、26.6%和52.5%，同化脫氮貢獻(xiàn)率分別為98.5%、73.4%和47.5%；8 h時，三株菌對TN的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率分別為25.3%、25.9%和42.6%，同化脫氮貢獻(xiàn)率分別為74.7%、74.1%和57.4%；12 h的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率和同化脫氮貢獻(xiàn)率與8 h時的相差不多；對于菌株S1，8 h時對TN的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率達(dá)最大；而對于S2和S3，4 h 時對TN的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率達(dá)最大。綜上所述，對于菌株S3脫除TN，0~4 h時以反硝化作用為主。

圖4 三株菌對TN的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率和同化脫氮貢獻(xiàn)率

由圖3結(jié)合公式3計算可知三株菌的好氧反硝化速率，結(jié)果如表1所示。對于這三株菌，8~12 h試驗期間其對應(yīng)的反硝化速率均降為0，說明該時間段內(nèi)反硝化作用均停止，所以僅針對分階段0~4 h、4~8 h和整個階段0~8 h內(nèi)的反硝化速率進(jìn)行考察。對于菌株S1，隨著處理時間的延長，反硝化速率先增大后減小，而對于菌株S2、S3，反硝化速率均逐漸降低；0~4 h內(nèi)，菌株S3的反硝化速率最大，達(dá)0.62 mg·L-1·h-1；4~8 h內(nèi)，菌株S1的反硝化速率最大，達(dá)0.45 mg·L-1·h-1；而0~8 h內(nèi)，菌株S3的平均反硝化速率仍最大，達(dá)0.42 mg·L-1·h-1。

表1 三株菌的反硝化速率(mg·L-1·h-1)

2.5 好氧反硝化菌株的系統(tǒng)分類學(xué)鑒定

對細(xì)菌16 S rDNA序列進(jìn)行同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖5），可知：S1與strain 84的16S rDNA序列具有99%的相似性，說明二者的同源性最近；S2、S3分別與strain B18的16S rDNA序列均具有99%的相似性，說明S2、S3分別與菌屬的同源性均最近，故將S1鑒定為土生拉烏爾菌屬（），S2和S3均鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌屬（）。

a：S1， b：S2，c：S3

3 討論

經(jīng)鑒定，分離篩選得到的菌株S1為土生拉烏爾菌屬（），菌株S2 和S3均為解鳥氨酸拉烏爾菌屬（）。本研究首次報道S1、S2 和S3為好氧反硝化菌。

Miyahara的研究表明，與NO3--N對比而言，NO2--N是施氏假單胞菌TR2更好的反硝化底物[8]，本研究的結(jié)果也驗證了這一結(jié)論。這3株菌在好氧條件下均能直接以NO3--N和NO2--N為底物進(jìn)行反硝化，并且亞硝酸鹽脫氮率高于硝酸鹽脫氮率，前者24 h去除率約為后者的2.6倍。說明這三株菌更容易利用亞硝酸鹽實現(xiàn)好氧反硝化。雖然同一菌株對不同氮源的利用情況不同，但氮含量的大幅變化均發(fā)生于菌株的對數(shù)生長期，這也與文獻(xiàn)報道的一致[9]。

以硝酸鹽為唯一氮源時，中間產(chǎn)物NO2--N濃度呈先升后降的趨勢。這是由于微生物優(yōu)先選擇氧化還原電位高的底物作為電子受體[9]，NO3--N被優(yōu)先利用，其還原產(chǎn)物NO2--N故而累積，但也并非將NO3--N全部還原為NO2--N后才開始利用后者，因而NO3--N和NO2--N之間沒有激烈的競爭[10]。

不離心和離心菌體的情況下，各時間段內(nèi)菌株S3的TN去除率均最大，其中8 h時分別可達(dá)32.4%和91.4%；而菌體脫除TN包括胞外還原反硝化和胞內(nèi)同化兩條途徑，其中0~4 h期間S3對TN的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率最大，可達(dá)52.5%；該時間段內(nèi)S3的反硝化速率也最大，達(dá)0.62 mg·L-1·h-1，4 h后則效率降低，可能是由于該低氮濃度的培養(yǎng)基中4 h后氮源濃度大幅降低，因而制約反硝化速率；另外，S3進(jìn)行硝酸鹽反硝化時的NO2--N積累量最小，并且最快得到完全脫除，以上結(jié)果均說明S3為脫氮效率最優(yōu)的菌株，同時表明各菌株對低氮濃度的模擬富營養(yǎng)化水質(zhì)也有較好的反硝化效果，在實際富營養(yǎng)化景觀水體的脫氮應(yīng)用中具有一定的潛在價值。

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Screening, Identification and Denitrification Characteristics of

ZHANG Yu-yan1, HEGen-he2, LU Li-jun1, LIU Jia1,*HUANG Xiang-feng1, LIANG Liang-liang2

(1.College of Environmental Science and Engineering,Tongji University, Shanghai 200092, China; 2.School of Life Science, Jinggangshan Universtity, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

Three aerobic denitrifiers（S1, S2 and S3）were abtained by isolating and screening. Strain S1 was identified as, while strains S2 and S3 were identified as. It is first reported that the three bacteria are aerobic denitrifiers. Studies on their aerobic denitrification characteristics showed that significant changes of nitrogen level in culture media occurred in the logarithmic growth phase of strains; in the studies on using nitrate or nitrite as sole nitrogen source, respectively, the removal rates of NO3--N and NO2--N were 26% and 67% at 24 h, respectively, which proved that nitrite was used more easily for aerobic denitrification of three strains;Results also showed that S3 was optimal strain with the highest removal efficiency of nitrogen, which had better denitrification effects on eutrophic water with low concentration nitrogen, and S3 had the highest denitrification rate of 0.62 mg·L-1·h-1and denitrification contribution rate of TN up to 52.5% at 4 h.

; screening and identification; eutrophication; denitrification characteristic

X172；X703.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.04.001

1674-8085(2014)04-0001-06

2014-03-09；

2014-05-11

國家科技支撐計劃項目(2012BAC11B04)

張宇燕(1985-)，女，山西大同人，博士生，主要從事環(huán)境微生物技術(shù)及水污染控制研究(E-mail: yuyanzh2012@126.com)；

賀根和(1977-)，男，江西永豐人，副教授，博士，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究(Email:genhexh@gmail.com)；

陸麗君(1982-)，女，上海人，講師，碩士，主要從事環(huán)境微生物技術(shù)及水污染控制研究(Email: lulijun@#edu.cn)；

劉 佳(1982-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，高級工程師，博士，主要從事環(huán)境微生物技術(shù)及水污染控制研究(Email: liujia@#edu.cn)；

*黃翔峰(1974-)，男，福建寧德人，教授，博士，主要從事環(huán)境微生物技術(shù)及水污染控制研究(E-mail: hxf@#edu.cn)；

梁亮亮(1993-)，男，江西瑞昌人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(Email:18079611044@126.com).