張儼，馬晴雯,2

1.上海交通大學 醫(yī)學院，上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學 附屬兒童醫(yī)院，上海交通大學 醫(yī)學遺傳研究所，上海200040；2.衛(wèi)生部醫(yī)學胚胎分子生物學重點實驗室暨上海市胚胎與生殖工程重點實驗室，上海 200040

多順反子載體在基因操作中具有重要的應用價值。目前常用的構建多順反子載體的策略有：構建多啟動子表達載體、構建剪切載體、表達融合基因、基因之間以內部核糖體插入位點（IRES）連接等。但這些構建方法往往有載體容量有限、受細胞類型限制及不能表達多個蛋白等缺點。最近幾年發(fā)展出了自裂解多肽2A（self-cleaving 2A peptide）相關的構建多順反子載體的新技術。自裂解多肽2A可應用于多順反子載體的構建，具有結構短小、上下游基因表達平衡性好、可用于共表達多個蛋白等優(yōu)點，是一種構建多順反子載體的有效工具[1]。

近幾年，利用2A多肽構建多順反子表達載體的技術在干細胞研究中得到了大量應用。2008年，Sommer等[2]聯合應用2A和IRES首次構建了一種多順反子慢病毒載體，該載體可同時表達Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc等4種轉錄因子，并成功地將新生兒成纖維細胞誘導成iPS細胞。Carey等[3]使用不同來源的2A序列（T2A、E2A和P2A）作為連接元件，構建了含有Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc轉錄因子的多順反子載體，并且分別在胚胎和成體細胞水平成功地誘導了小鼠和人體細胞的重編程。最近，有研究者分別使用IRES、F2A序列連接O（6）-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶基因和多藥耐藥性基因，通過細胞轉染使這2個基因在造血干細胞系中過表達；與IRES的連接相比，F2A的連接對細胞起到了更好的保護效果[4]。我們采用來自一點褐翅蛾病毒（TaV）的T2A構建共表達載體pCMV-GFP-T2A-Neo，轉染牛耳皮膚成纖維細胞，分析GFP和Neo基因在分子和細胞水平的表達情況，為在轉基因牛制備中利用2A進行多基因轉移操作提供基礎數據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠成纖維細胞NIH3T3為本所保存；原代牛耳皮膚成纖維細胞由本所大動物實驗基地提供；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；質粒pEGFP-N1和pcDNA3.1（+）分別購自Clontech和Invitrogen公司。

DMEM/F12培養(yǎng)液、血清、PBS和TRIzol試劑購自Life Technologies公司；胰蛋白酶購自Becton Dickinson公司；G418購自國藥集團化學試劑有限公司；FuGENE HD轉染試劑購自Roche公司；限制性內切酶、T4DNA連接酶和Phusion超保真DNA聚合酶購自NEB公司；Taq酶、SYBR熒光定量PCR試劑和PrimeScript反轉錄酶購自TaKaRa公司；PCR純化試劑盒和膠回收試劑盒購自Qiagen公司；引物及T2A合成由Life Technologies公司完成。

1.2 載體pCMV-GFP-T2A-Neo的構建

以NarⅠ和BamHⅠ雙酶切pcDNA3.1（+），去除SV40啟動子。因切除SV40啟動子時，Neo基因的部分片段也被切除，因此，以pcDNA3.1（+）為模板擴增含有被切除的Neo基因片段（引物序列見表1），并與上述經NarⅠ和BamHⅠ酶切的pcDNA3.1（+）載體相連，得到pcDNA3.1-CMV-Neo。將合成的T2A及其互補單鏈T2Arc（分別含有限制性內切酶NheⅠ和BamHⅠ粘性末端，序列見表1）干粉配制為100 μmol/L的溶液后等摩爾混合，于100℃沸水中待其自然冷卻，即得到兩側分別為NheⅠ和BamHⅠ粘性末端的T2A雙鏈，將其連入pcDNA3.1-CMV-Neo相應的酶切位點處，得到pcDNA3.1-CMV-T2A-Neo。以pEGFP-N1為模板，PCR擴增含有NheⅠ和AvrⅡ酶切位點的GFP基因，接入pcDNA3.1-CMV-T2A-Neo中，得到目的載體pCMV-GFP-T2A-Neo。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染

接種適量NIH3T3細胞或牛耳成纖維細胞至6孔板中，培養(yǎng)至85%～95%匯合度時進行細胞轉染。需轉染的質粒用無內毒素質粒提取試劑盒制備。采用相同方法轉染NIH3T3細胞和牛耳成纖維細胞。轉染前進行細胞換液，每孔細胞中加入2 mL新鮮培養(yǎng)基（DMEM/F12+10%血清）。6孔板中每孔細胞的轉染操作如下：取3.3 μg DNA加入不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，吹打混勻，配成體積為157 μL的DNA混合液，隨后將DNA（μg）和轉染試劑（μL）按1∶3的比例加入9.9 μL FuGENE HD轉染試劑，輕輕吹打混勻，室溫靜置20 min，將轉染復合物逐滴加入6孔板的細胞中，輕輕搖勻。另設轉染pEGFP-N1質粒的陽性對照組和未轉染質粒的空白對照組。轉染12 h后，換新鮮的含血清DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 熒光激活細胞分選（FACS）分析

轉染48 h后，胰酶消化收集細胞，用PBS洗滌1～2次，取1×105以上的細胞用鞘液重懸，用流式細胞儀分析NIH3T3和牛耳皮膚成纖維細胞中pCMVGFP-T2A-Neo的轉染效率及EGFP的表達情況。

1.5 熒光定量PCR

轉染牛耳皮膚成纖維細胞48 h后，收集轉染組和空白對照組細胞，用TRIzol法提取細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA后用熒光定量PCR方法檢測GFP、T2A和Neo基因在mRNA水平的表達。引物及序列見表2。采用GraphPaD Prism 5軟件分析熒光定量PCR數據。

2 結果

2.1 共表達載體pCMV-GFP-T2A-Neo構建

表1 構建pCMV-GFP-T2A-Neo載體所用引物

構建了共表達載體pCMV-GFP-T2A-Neo（5067 bp），經NheⅠ和BglⅡ酶切鑒定（圖1），證明T2A序列已成功接入載體中。

2.2 熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達

熒光顯微鏡下觀察牛耳皮膚成纖維細胞轉染pCMV-GFP-T2A-Neo后24 h綠色熒光蛋白的表達，以轉染pEGFP-N1的細胞作為對照，結果見圖2，pCMV-GFP-T2A-Neo可使GFP有效表達。

2.3 FACS檢測GFP在牛耳皮膚成纖維細胞和NIH 3T3細胞中的表達

采用FACS檢測2種細胞中GFP的表達情況，結果見圖3。pCMV-GFP-T2A-Neo可在原代培養(yǎng)的牛耳皮膚成纖維細胞和NIH3T3細胞中有效表達GFP，但表達水平低于pEGFP-N1，與熒光顯微鏡下觀察到的結果一致。

表2 熒光定量PCR引物

圖1 pCMV-GFP-T2A-Neo載體的酶切鑒定結果

2.4 定量PCR檢測目的基因的表達

定量PCR結果如圖4，在轉錄水平上，GFP、T2A和Neo表達水平相當，處于同一個數量級。

3 討論

利用一個啟動子實現多基因共同表達，在轉基因克隆動物制備中具有重要的應用價值。相對于構建多啟動子表達載體、構建剪切載體、表達融合基因、基因之間以IRES連接等共表達載體構建策略，2A序列在構建多順反子載體中具有序列短小、易操作、上下游基因表達平衡性好等優(yōu)點，其在腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺相關病毒載體和質粒載體的構建中都得到了廣泛應用。我們利用T2A元件構建的GFP和Neo共表達載體在轉入牛耳皮膚成纖維細胞后能夠正常翻譯，T2A及其相連的2個基因的mRNA表達量處于同一數量級。此外，T2A能夠在牛耳成纖維細胞中發(fā)揮自裂解功能，可將其作為一種平衡性較好的共表達策略應用于牛耳皮膚成纖維細胞。但目前2A自裂解的機制尚不清楚，且可能存在未剪切前體，同時上游蛋白C端2A殘基的殘留可能影響蛋白的功能和定位[5-6]，如GFPT2A-Neo翻譯后T2A介導的斷裂會使上游的GFP帶上一段十幾個氨基酸殘基的多肽，這段多肽可能會影響GFP的高級結構，進而影響綠色熒光的強度，這有可能是造成牛耳成纖維細胞及NIH3T3細胞中GFP表達水平較pEGFP-N1載體上GFP單一表達框表達水平低的原因。相信隨著研究的深入，自裂解多肽2A將會作為構建多順反子載體的強有力工具應用于轉基因牛的生產，若能同時與多種提高轉基因表達水平的策略[7]相結合，有望提高表達轉基因大動物的制備效率。

圖2 牛耳皮膚成纖維細胞綠色熒光蛋白的表達（40×）

圖3 牛耳皮膚成纖維細胞和NIH3T3細胞中GFP的表達

圖4 定量PCR檢測牛耳皮膚成纖維細胞轉染pCMV-GFP-T2A-Neo后細胞中GFP、T2A和Neo的表達

[1]張儼,李振海.多順反子載體構建的策略及進展[J].醫(yī)學分子生物學雜志,2012,9(5-6):429-433.

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[3]Carey B W,Markoulaki S,Hanna J,et al.Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(1):157-162.

[4]Maier P,Heckmann D,Spier I,et al.F2A sequence linking MGMT(P140K)and MDR1 in a bicistronic lentiviral vector en?ables efficient chemoprotection of haematopoietic stem cells[J].Cancer Gene Ther,2012,19(11):802-810.

[5]Ryan M D,King A M,Thomas G P.Cleavage of foot-andmouth disease virus polyprotein is mediated by residues locat?ed within a 19 amino acid sequence[J].J Gen Virol,1991,72(Pt 11):2727-2732.

[6]Ryan M D,Drew J.Foot-and-mouth disease virus 2A oligo?peptide mediated cleavage of an artificial polyprotein[J].EM?BO J,1994,13(4):928-933.

[7]孫世惠,林艷麗,鄧繼先.提高轉基因表達水平的策略[J].生物技術通訊,2005,16(2):197-200.