郄霜，戴振華，楊錫琴，修冰水 ，陳堃 ，郭蘭芹，馮曉燕，張慶波，張賀秋

1.河北聯(lián)合大學，河北 唐山 063000；2.軍事醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所，北京 100850；3.華北石油總醫(yī)院，河北 任丘 062552

結(jié)核分枝桿菌感染所導致的結(jié)核病對人類健康依然是極大的威脅，全世界高達三分之一的人口是潛在的結(jié)核分枝桿菌感染患者，每年平均死亡人數(shù)達到170萬[1]。目前我國結(jié)核病診斷及流行病學調(diào)查主要采用結(jié)核菌素純蛋白衍化物（PPD）檢測，但PPD檢測包含的抗原復雜，導致難以區(qū)別結(jié)核桿菌感染和卡介苗接種，因此，尋找特異性更高、敏感性更強的抗原是目前結(jié)核病診斷研究的首要任務。

致病性結(jié)核分枝桿菌區(qū)別于卡介苗（BCG）的一個重要特征是，結(jié)核分枝桿菌的基因組中存在RD1區(qū)，而所有環(huán)境分枝桿菌及BCG中均缺失該區(qū)序列。研究表明，敲除RD1區(qū)的結(jié)核分枝桿菌H37RV與BCG疫苗株的毒力相當，因此推斷RD1區(qū)與細菌的毒力有關[2]。我們對H37RV株RD1區(qū)的Rv3871抗原優(yōu)勢肽段進行了克隆、表達及純化，初步檢測了其抗原性，希望為結(jié)核病的臨床檢測提供新型抗原。

1 材料和方法

1.1 材料

所有血清均來自北京市朝陽區(qū)疾病預防控制中心，全部為臨床新近診斷的活動性肺結(jié)核患者，未合并感染HIV，未接受抗結(jié)核治療或治療時間不超過2周；陰性對照組來自健康獻血員。

結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA、大腸桿菌HB101由本室保存；在大腸桿菌中高效表達目的基因的載體pBVIL1由本室構(gòu)建；實驗所需DNA限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ，及T4DNA連接酶均購自Promega公司。

1.2 抗原表位分析

用Biosun分子生物學軟件對Rv3871抗原進行表位分析，將其分成3個優(yōu)勢抗原表位，分別為Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3。

1.3 基因克隆與載體構(gòu)建

針對用Biosun軟件分析而得的Rv3871的3段優(yōu)勢肽段基因序列及質(zhì)粒pBVIL1克隆位點序列設計PCR引物。Rv3871-1基因上游引物為P1（5'-GCC TCGAGACTGCTGAACCGGAAGTACGGA-3'），下游引物為 P2（5'-GCTCTAGAACCGGGCCATCCGTCG ATGAT-3'）；Rv3871-2基因上游引物為 P3（5'-GC CTCGAGATCGCTTCCCAGCACACCGAA-3'），下 游引物為 P4（5'-GCTCTAGAAATCTCCCAGCGAGTG CGGTA-3'）；Rv3871-3基因上游引物為P5（5'-GC CTCGAGATCGCTTCCCAGCACACCGAA-3'），下 游引物為 P6（5'-GCTCTAGAACCGGGCCATCCGTCG ATGAT-3'）。上、下游引物5'端分別引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點。

以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組為模板進行PCR擴增，反應體系包括H37Rv株基因組DNA 1.0 μL、超純水45 μL、酶50 μL、引物各2.0 μL，總體積為100 μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA膠回收試劑盒純化回收擴增產(chǎn)物，由中美泰和生物技術公司測序，將測序正確的目的基因用XhoⅠ和XbaⅠ酶切，并將其與經(jīng)相同酶切的pBVIL1原核表達載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，對氨芐西林（Amp）抗性培養(yǎng)菌落進行菌落PCR鑒定，并對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，陽性克隆用于誘導表達。

1.4 表達純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，挑取單一克隆接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp），37℃搖床振搖培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的比例接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp），37℃振搖培養(yǎng)2～3 h，轉(zhuǎn)至42℃水浴誘導表達4 h以上，收集菌體，提取包涵體與上清，進行SDSPAGE。重組蛋白的純化參照文獻[5]進行。

1.5 活性檢測

用純化的結(jié)核分枝桿菌抗原Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3分別包被酶聯(lián)測定板，用間接ELISA方法檢測結(jié)核陽性患者和健康獻血員，測定D450nm值，評價抗原的反應活性。

2 結(jié)果

2.1 抗原表位分析

圖1 Biosun分子生物學軟件對Rv3871抗原的分析結(jié)果

用Biosun分子生物學軟件對Rv3871抗原進行抗原表位分析，將Rv3871抗原分成3個優(yōu)勢抗原表位，分別為 Rv3871-1（10～190 aa）、Rv3871-2（310～370 aa）和Rv3871-3（510～580 aa）（圖1）。

2.2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳鑒定

以H37Rv基因組DNA為模板，分別擴增Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3抗原基因片段，相應的PCR產(chǎn)物大小分別為540、180和210 bp（圖2）。

2.3 重組質(zhì)粒的測序鑒定

用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切擴增的基因，得到相應的目的基因，連接到經(jīng)同樣雙酶切的pBVIL1載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒的測序結(jié)果表明所擴增的基因序列完全正確（序列略）。

2.4 抗原的表達純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，對經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定陽性的克隆進行熱誘導。由于目的基因與載體上的一段IL1基因相融合，因此表達的Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3重組蛋白的相對分子質(zhì)量分別約為 39.2×103、21.6×103和 22.5×103。將大量誘導表達的菌體用超聲波破碎，對表達于包涵體內(nèi)的各重組蛋白進行離子交換柱純化。相關SDS-PAGE結(jié)果如圖3。

2.5 間接ELISA檢測抗原活性

圖2 抗原基因片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果

分別用純化的抗原Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3包被酶聯(lián)板，通過ELISA方法檢測40例結(jié)核病患者、36例健康體檢者，對檢測結(jié)果用Graph?Pad Prism 4軟件進行統(tǒng)計學分析，確定cut-off值，表明差異有統(tǒng)計學意義（圖4）。對3個抗原優(yōu)勢肽段進行IgG檢測，Rv3871-1的敏感性為32.5%（13/40，t=6.091，P＜0.001），特異性為97.2%；Rv3871-2的敏感性為45%（18/40，t=5.756，P＜0.001），特異性為100%；Rv3871-3的敏感性為37.5%（15/40，t=4.847，P＜0.001），特異性為91.6%。Rv3871-2優(yōu)勢肽段的檢測效果最佳。參見表1、2。

3 討論

圖3 重組菌的SDS-PAGE

表1 抗原優(yōu)勢肽段Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3的ELISA檢測結(jié)果

表2 抗原優(yōu)勢肽段Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3的特異性和敏感性

圖4 Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3抗原的活性

對于結(jié)核病的血清學檢測，檢測試劑的敏感性與特異性一直是困擾科研工作者和醫(yī)務人員的難題，其主要原因是檢測試劑所用的抗原種類和質(zhì)量問題仍未解決。因此，尋找敏感性高、特異性好的結(jié)核病診斷抗原一直是研究重點[6]。目前比較成熟的結(jié)核病診斷試劑盒大多選用分泌性抗原或多抗原聯(lián)合檢測[7]。本研究主要針對結(jié)核分枝桿菌H37Rv株RD1區(qū)編碼蛋白進行。RD1區(qū)編碼蛋白（Rv3871～Rv3879c）是結(jié)核分枝桿菌在長期傳代過程中丟失的特異性保護性抗原，僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中，在BCG及環(huán)境分枝桿菌中缺失[8]，從而使其在結(jié)核病的免疫學診斷和預防中發(fā)揮重要作用。Rv3871是膜結(jié)合ATP水解酶的組成部分，是轉(zhuǎn)錄形成單位，有2個ATP/GTP結(jié)合位點[9]。

目前關于Rv3871蛋白的研究較少。我們對Rv3871抗原進行了表位分析，將該抗原分成3段，利用本室構(gòu)建的原核表達載體pBVIL1進行抗原優(yōu)勢肽段的表達純化，發(fā)現(xiàn)3個抗原優(yōu)勢肽段都能高效表達。在先前的研究中，曾用多種載體對Rv3871抗原進行全長表達，但均未成功。本研究中，通過表達抗原優(yōu)勢肽段，避免了由于抗原本身分子較大，不易表達的缺點。

通過間接ELISA法對3個抗原優(yōu)勢肽段免疫活性進行初步檢測，發(fā)現(xiàn)Rv3871-2抗原優(yōu)勢肽段的敏感性和特異性均高于Rv3871-1和Rv3871-3。由此可以推斷Rv3871-2抗原在3個抗原中效果最佳。

抗原優(yōu)勢肽段的檢測可以克服抗原蛋白分子較大而不易克隆表達的缺點，同時也可以克服由于蛋白自身結(jié)構(gòu)復雜，相互折疊，使線性表位被覆蓋而不能充分表現(xiàn)其抗原活性的缺點。本研究結(jié)果表明，Rv3871-2抗原在pBVIL1載體中可以高效表達，同時該抗原在3個優(yōu)勢肽段中活性最好。該抗原可以與其他RD1區(qū)抗原如ESAT-6、CFP-10聯(lián)合用于檢測，以提高檢出率，同時又可以保持特異性。但是目前對Rv3871抗原的研究較少，需要進一步擴大臨床樣品評價，探討抗原在結(jié)核病檢測中的應用價值。

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[2]姚翠梅,孫長江,張智勇，等.結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)T細胞表位分布情況預測及分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(25):15218-15221.

[3]宋曉國,凌世淦,張賀秋,等.高效原核融合表達載體（pBVILⅠ）的構(gòu)建及在HCV表達中的應用[J].細胞與分子免疫學雜志,2001,17(3):231-233.

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[5]王國華,陳坤,宋曉國,等.基于結(jié)核分枝桿菌分泌抗原的新型結(jié)核診斷試劑研究[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2009,24(4):59-61.

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