張航，胡俊杰，湯瑞華，葉金波，任曉虎,胡韜，黃培武，楊細飛，黃海燕，劉建軍

1.深圳大學 生命科學學院，廣東 深圳 518060；2.深圳市疾病預防控制中心 現(xiàn)代毒理學重點實驗室，廣東 深圳 518055

DNA甲基化是在特異的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化作用下，將S-2腺苷甲硫氨酸（S-2 adenosine methionine，SAM）上的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶C-5位點形成甲基化DNA分子的過程[1]。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一，其在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育過程中起著極其重要的作用[2]。胞嘧啶甲基化的異常與腫瘤抑癌基因的沉默密切相關，并在很多疾病的發(fā)生發(fā)展中起決定性作用[3-4]。近年來，不斷有研究顯示人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化的異常有關，而且早在腫瘤臨床確診之前就可檢測出特異基因的甲基化異?，F(xiàn)象[5]。因此，甲基化可以作為腫瘤等早期診斷的生物標志物和預后評估指標，對腫瘤篩查、風險評估、早期診斷、分期分型、預后判斷及治療監(jiān)測都具有重要意義[5]。隨著DNA甲基化研究的不斷深入，其檢測方法也層出不窮。這些方法針對不同的研究目的，運用不同的處理，幾乎涵蓋了從基因到基因組各個層次水平的研究。在本實驗中，我們總結了前人的各種研究方法，建立了在色譜技術檢測基礎上用串聯(lián)質(zhì)譜檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS/MS）技術。該方法具有高靈敏度、高通量、高分辨率且重復性好等優(yōu)點，為DNA甲基化的快速精確檢測提供了新策略。

1 材料和方法

1.1 材料

LC-20A型全自動高效液相色譜系統(tǒng)（島津公司）；API 4000 Q-Trap型質(zhì)譜檢測器（AB SCIEX公司）；186001301型Atlantis dC18色譜柱（2.1 mm×150 mm i.d，5 μm粒徑）（Waters公司）；色譜柱保護柱（2.1 mm×20 mm i.d，5 μm粒徑）（Phenomenon公司）；MILLI-QA10超純水系統(tǒng)（Millipore公司）；For?ma 725型-80℃低溫冰箱（Thermo Forma公司）；BP1211S型電子天平（Sartorius公司）。

2-脫氧鳥嘌呤核苷（2-deoxyguanosine，dG）、鳥嘌呤核苷（guanosine，G）、腺嘌呤核苷（adenosine，A）、2-脫氧腺嘌呤核苷（2-deoxyadenosine，dA）、尿嘧啶核苷（uridine，U）、胞嘧啶核苷（cytidine，C）、胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）、2-脫氧胞嘧啶核苷（2-deoxycytidine，dC）、5-甲基-脫氧胞苷（5-methyl-de?oxycytidine，5-mdC）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、碳酸氫銨（色譜純）、醋酸銨（色譜純）、堿性磷酸酶購自Sigma-Aldrich公司；實驗用水為超純水。

1.2 溶液配制

1.2.1 儲備液和標準工作溶液 用電子天平分別稱取A、G、T、C、dA、dG、dC、U和5-mdC各50 mg，溶于50 mL H2O，配制為1 mg/mL的儲備液，充分振蕩至溶液清澈。將 5-mdC和dG的儲備液用H2O稀釋配制成濃度梯度為1、10、100、500、1000 ng/mL的混合標準工作溶液。稀釋儲備液，將不同濃度的5-mdC（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 ng/mL）加入500 ng/mL dG中，所形成的混合標樣中5-mdC與dG的質(zhì)量比值分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%，充分振蕩混勻。以上溶液均保存于-20℃冰箱，使用時提前室溫平衡。

1.2.2 流動相 A相為甲酸-水（1 mL甲酸溶于1000 mL H2O），B相為甲酸-甲醇（1 mL甲酸溶于1000 mL甲醇）。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件 將固定相色譜柱與保護柱連接，并連接流動相樣品瓶（A相和B相）。流動相設置洗脫時間為0～24 min，B流動相所占流動相總體積為0～18%，流速為0.22 mL/min，柱溫為25℃，進樣量為10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源，干燥器溫度為450℃，噴霧器為氮氣（N2），噴霧壓力為4500 V，掃描方式為多反應檢測（multiple reaction moni?toring，MRM）模式。啟動自動優(yōu)化程序后，分別將5-mdC和dG的標準工作溶液進樣檢測分析，進行碰撞能和去簇電壓等質(zhì)譜工作參數(shù)的優(yōu)化，同時對檢測限、基質(zhì)效應、標準工作曲線和重現(xiàn)性等參數(shù)進行探討分析。

2 結果

2.1 母/子離子對

采用針泵連續(xù)進樣，在正離子模式下分別對標準溶液進行母離子全掃描，確定分子離子，優(yōu)化各分子離子的錐孔電壓。分別以上述離子為母離子，對其子離子進行全掃描。優(yōu)化后的多反應監(jiān)測母子離子對是：A（m/z 268.1→136.1）、dA（m/z 252.3→135.9）、C（m/z244.1→112.2）、dC（m/z228.0→112.2）、5-mdC（m/z 241.9→126.3）、G（m/z 284.1→152.3）、dG（m/z268.2→152.1）、T（m/z243.3→127.2）和 U（m/z 245.1→112.9）。選取其中信號較強、干擾較小的子離子與母離子組成監(jiān)測離子對。5-mdC和dG的標準工作溶液（5 μg/mL）經(jīng)質(zhì)譜檢測后的全掃描質(zhì)譜圖顯示了電噴霧形成的離子化5-mdC及dG分別在質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio，m/z）為241.9及268.1處存在最強的響應峰，分別對應于相應的母離子。同時5-mdC和dG對應的子離子分別是m/z 126.3及m/z 152.3（圖1）。所以，在進行5-mdC及dG的定量檢測時，MRM模式采用的母/子離子對分別是5-mdC（m/z 241.9→126.3）和dG（m/z 268.2→152.1）。

2.2 碰撞能和去簇電壓

對5-mdC和dG標準品連續(xù)進樣監(jiān)測分析后，得出了1000 ng/mL的5-mdC和dG標準品在ESI陽離子電離模式條件下的響應值與不同的碰撞能和去簇電壓間的關系（圖2）。經(jīng)自動優(yōu)化程序優(yōu)化后的5-mdC和dG碰撞能均為15 eV，而去簇電壓分別是40和45 V。

2.3 MRM總離子流圖

圖1 在ESI陽離子電離模式下5-mdC（A）和dG（B）的子離子圖

圖2 在ESI陽離子電離模式下5-mdC和dG（1000 ng/mL）的響應值隨碰撞能和碎片電壓的變化

圖3給出了標準溶液的正常核苷和修飾核苷（A、dA、C、dC、5-mdC、G、dG、T和U）的典型MRM總離子流圖，說明以上化合物能實現(xiàn)良好的基線分離，且它們各自的保留時間先后有序，互不干擾，從而有效確保了其他核苷不會干擾5-mdC和dG的定量檢測分析。

2.4 標準工作曲線和檢測限

以混合標樣中5-mdC和dG物質(zhì)的質(zhì)量比值和它在質(zhì)譜中的響應面積的比值構建回歸曲線，獲得定量基因組DNA甲基化率的標準工作曲線（圖4，回歸曲線方程為y=0.626x+0.0212，R2=0.9999），具備良好的線性相關性，可用于甲基化率的定量分析。1000 ng/mL的5-mdC和dG不斷梯度稀釋后連續(xù)進樣分析，在信噪比≥10的條件下，5-mdC的最低定量限（limit of quantitation，LOQ）為 1.65 fmol，dG 的LOQ為2.47 fmol，相當于0.2 ng的DNA發(fā)生了1%的甲基化也能檢出。

2.5 基質(zhì)效應

為了排除酶解緩沖液（包括0.1 mmol/L醋酸銨1 μL、1 mol/L碳酸氫銨1 μL、堿性磷酸酶溶解緩沖液1 μL和H2O 7 μL）和H2O對5-mdC和dG的響應值的影響，我們將不同濃度的5-mdC和dG標準品分別加入酶解緩沖液和H2O混勻，進樣檢測，比較響應值差異，結果見表1、2，響應值比為90%～110%，說明基質(zhì)效應不會干擾樣品的實際檢測分析。

2.6 重現(xiàn)性

以全基因組DNA甲基化率分別為1%、5%、10%的標準樣品為質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品，在1 d內(nèi)的3個時間點（天內(nèi)誤差）和連續(xù)5 d內(nèi)（天間誤差）分別檢測分析QC樣品，并計算QC樣品中5-mdC含量的相對標準偏差（RSD，%）。結果顯示質(zhì)量控制標準樣品5-mdC含量的天內(nèi)誤差和天間誤差均小于8%，說明該技術具有很好的穩(wěn)定性。

3 討論

圖3 正常和修飾核苷的典型MRM離子流圖

圖4 基因組DNA甲基化率標準工作曲線

表1 5-mdC的基質(zhì)效應

表2 dG的基質(zhì)效應

近年來，基因組DNA甲基化的研究方法不斷發(fā)展，主要可分為全基因組甲基化檢測和特異基因的甲基化檢測。全基因組亞硫酸氫鹽和亞硫酸氫鹽焦磷酸測序，是以亞硫酸氫鹽修飾為基礎的檢測基因組整體甲基化水平的方法，兩者都具有精確度高和能定量的優(yōu)點[6]。前者還具有較強的可靠性和較高的基礎分辨率，但檢測過程復雜，既耗時又價格昂貴；后者簡單快速，不足之處是只能檢測長度小于100 bp的DNA序列[6]。SssⅠ甲基轉(zhuǎn)移酶法是在該酶的作用下使基因組DNA的CpG位點發(fā)生甲基化，通過測定剩余的放射性標記的SAM即可得到原基因組整體甲基化水平。這種方法的缺點是所使用的SssⅠ甲基轉(zhuǎn)移酶不穩(wěn)定，致使結果不夠精確，并且常常伴隨放射性污染[7]。特異性的抗5-mdC抗體免疫熒光法[8]，所需樣品量大且精確性較低。高效液相色譜法[9]是一種比較傳統(tǒng)的方法，能夠定量測定基因組整體DNA甲基化水平，卻不能對甲基化的CpG位點進行定位。這些方法都伴隨著各種各樣的不足與缺陷，給實驗者在甲基化檢測過程中帶來很多困擾。本實驗建立的HPLC-ESI-MS/MS技術具有高靈敏度、高通量、高準確率、高分辨率且重復性好的特點，有望成為甲基化研究的關鍵方法之一，尤其在檢測大樣本中的微量甲基化時顯示了極大優(yōu)勢。

為了消除儀器對化合物響應值的波動所造成的定量誤差，HPLC-ESI-MS/MS技術成為DNA甲基化定量方法的核心之一，相關報道采用外標法或利用5-mdC和dC的同位素內(nèi)標進行定量，包括15N3-dC和15N5-dG[10]、［U-15N］-dC和［U-15N］-5-mdC[11]等，但由于同位素內(nèi)標價格昂貴和外標操作上的繁瑣而不能大量投入使用。我們利用5-mdC和dG標準品構建標準曲線，以dG為內(nèi)標對全基因組DNA甲基化水平定量分析，利用G只能和C配對的原理，得到了全基因組DNA甲基化率的表達式：甲基化率=100×［5-mdC］/［dG］。雖然DNA序列中的部分dG可發(fā)生修飾，但此種修飾的堿基占正常堿基的比例微乎其微，所引起的誤差不會對檢測結果造成影響，可以忽略不計[10]。并且，以dG為內(nèi)標，能克服外標法檢測分析所存在的信號不穩(wěn)定和誤差較大的問題。

我們建立的HPLC-ESI-MS/MS檢測技術具有靈敏度高和特異性好的特點，經(jīng)過條件優(yōu)化，母/子離子對能特異地聯(lián)合鑒定目標化合物，可檢出0.2 ng的DNA中發(fā)生的1%甲基化，靈敏度可達億分之一以上。而且，抗干擾能力強，MRM總離子流圖顯示各核苷能實現(xiàn)良好的基線分離，不會對5-mdC和dG的定量檢測分析產(chǎn)生干擾；酶解緩沖液與ddH2O響應值比為90%～110%，基質(zhì)效應不會影響樣品的檢測分析。該方法還具備良好的穩(wěn)定性，質(zhì)量控制標準樣品甲基化率的天內(nèi)誤差和天間誤差均小于8%。同時，用該方法所建立的標準工作曲線具備良好的線性相關性，可用于甲基化率的定量分析。

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