寧文艷，吳先敏，王春梅*，陳偉東，施定基

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系，北京 100102;2.中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093)

魚腥藻7120(Anabaena sp.PCC7120)是一種絲狀固氮藍(lán)藻，是一類能進(jìn)行光合放氧的原核生物［1］，其作為模式植物被廣泛用于光合、固氮、細(xì)胞分裂與分化等基礎(chǔ)生命科學(xué)問題的研究。魚腥藻7120基因組序列已于2001年測定完成［2］。由于藍(lán)藻細(xì)胞可以利用簡單無機(jī)物合成有機(jī)物，表達(dá)的外源基因產(chǎn)物不形成包涵體，并且多數(shù)藍(lán)藻及其提取物對人畜無毒，因此有作為工業(yè)化生產(chǎn)基因工程藥物宿主的潛力。目前，大批可用于藍(lán)藻基因工程的載體已構(gòu)建完成，一些外源基因也已在藍(lán)藻細(xì)胞中成功表達(dá)，已成功表達(dá)的人源性因子有:人腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、泛素融合的胸腺素α1(Ubiquitin biding Thymosinum α1，UB-α1)和人表皮生長因子(human epidermal grow factor，hEGF)等［3］。最近，藍(lán)藻又成為合成生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，用于生產(chǎn)生物柴油等［4］。然而，藍(lán)藻中外源基因的表達(dá)效率低，已成為其長足發(fā)展的瓶頸［5］。對于魚腥藻7120中外源基因表達(dá)效率低的問題學(xué)者們從不同的角度進(jìn)行了探索，轉(zhuǎn)錄水平啟動子的調(diào)控是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［6-7］。至今，已有內(nèi)源性和外源性多種啟動子 PsbA、PglnA、PrbcL、PrbcA、Ptac、PpetE、PpsbBⅠ、PpsbBⅡ及 PfurA 等被用于研究［8］。1993年ELHAI J證明啟動子PsbA是魚腥藻7120的內(nèi)源強(qiáng)啟動子，成為魚腥藻7120穿梭表達(dá)載體最常用的啟動子之一，如pRL488、pSBJ2和pKT-MT［9］。Tac啟動子是大腸埃希菌中的強(qiáng)可誘導(dǎo)型啟動子，用于藍(lán)藻中表達(dá)外源基因也有較高的表達(dá)效率［10］，雖然之前的研究表明光調(diào)節(jié)的PsbA和IPTG誘導(dǎo)的Ptac啟動子是藍(lán)藻中高效的啟動子，但PsbA與Ptac兩者在藍(lán)藻中表達(dá)效率的比較研究未見報道。因此，本研究從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平比較了2種啟動子在藍(lán)藻中表達(dá)外源基因hG-CSF的表達(dá)效率，為藍(lán)藻基因工程的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。hG-CSF是全球銷量最大的原核生物表達(dá)的基因工程藥物，用于治療化療出現(xiàn)的白細(xì)胞減少癥［11］。本研究選此基因作為研究對象，為利用藍(lán)藻生產(chǎn)hG-CSF的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 穿梭表達(dá)質(zhì)粒pRL-489由美國密歇根大學(xué)Peter Wolk教授惠贈，穿梭表達(dá)質(zhì)粒pRL-PsbA-GCSF和含Tac啟動子表達(dá)的GCSF基因的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pRL-Tac-GCSF由北京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥系實(shí)驗室構(gòu)建，大腸埃希菌DH5α、HB101和野生型魚腥藻7120由北京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥系實(shí)驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ等限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶、PT-PCR試劑盒、ELISA試劑盒等購自TaKaRa公司;氨芐青霉素和卡那霉素抗生素、PCR擴(kuò)增酶購自上海生工;質(zhì)粒小量提取試劑盒及膠回收試劑盒購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司;100 bp DNA Ladders購自北京全式金公司;瓊脂糖試劑購于Promega公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。GeneAmp PCR System 9600(ABI公司);酶標(biāo)檢測儀(美國MD公司);DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠);HZQ-X100震蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)藻藻種培養(yǎng) 魚腥藻7120生長于BG-11培養(yǎng)液中，藻種的純化采用平板劃線分離［12］。擴(kuò)大培養(yǎng)時按1∶50的比例接種于50 mL三角瓶中，28 ℃、90 μmol·m－2·s－1光照條件下振蕩培養(yǎng)［13］。

1.2.2 穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)報道，設(shè)計并合成引物，P1:5'-CCGATAACGGTTCTGGCAAA-3'(HindⅢ酶切位點(diǎn):AAGCTT)，P2:5'-CGGGAAATTGTTATCCGCTCA-3'(BamHⅠ酶切位點(diǎn):GGATCC)。采用分子克隆技術(shù)，以PGEX表達(dá)載體為模板，94℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán);最后72℃延伸7 min，獲得Tac啟動子基因片段，產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收純化，經(jīng)HindⅢ與BamHⅠ雙酶切，TA克隆PMD-19-T Simple Vector，送上海生物工程技術(shù)有限公司測序。針對pUC-GCSF載體上的GCSF基因設(shè)計引物:GCSF上游引物:5'-CGGGAGGAAGTCATATGACTCC-3'(酶切位點(diǎn):BamHⅠGGATCC);GCSF下游引物:5'-CGTCATGGCTGGGCAAGG-3'(酶切位點(diǎn):EcoRⅠ GAATTC)。測序正確的Tac啟動子片段經(jīng)HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后與載體pUC-G-CSF經(jīng)雙酶切進(jìn)行大小片段連接，獲得中間載體 pUC-tac-G-CSF，再經(jīng) HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切、Klenow Fragment補(bǔ)齊與 pRL489質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ酶切，Klenow Fragment補(bǔ)齊后目的片段在T4連接酶的作用下進(jìn)行平末端連接(由于2個載體間沒有合適的確位點(diǎn))，最終得到穿梭表達(dá)載體pRL-tac-G-CSF。為確保所用樣品具有相同量的RNA，rnpB(320 bp)基因，作為RT-PCR內(nèi)參:rnpB上游引物:5'-ATAGTGCCACAGAAAAATACCG-3';rnpB下游引物:5'-AAGCCGGGTTCTGTTCTCTG-3'。

1.2.3 藍(lán)藻的轉(zhuǎn)化 采用三親接合轉(zhuǎn)移法［14］。①大腸埃希菌的準(zhǔn)備:在三親接合轉(zhuǎn)移的前一天晚上，將含有穿梭表達(dá)載體的大腸埃希菌及含有輔助質(zhì)粒pRL58和接合質(zhì)粒RP4的大腸埃希菌接種到20 mL含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜，4000 r/min離心5 min收菌，用普通LB培養(yǎng)液洗2次，重懸于5 mL普通LB培養(yǎng)液中，等體積混合2種菌液;②藍(lán)藻的準(zhǔn)備:取對數(shù)生長早期藍(lán)藻培養(yǎng)物于4000 r/min離心2 min收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌2次，再以適當(dāng)體積的培養(yǎng)液懸浮藻細(xì)胞(使細(xì)胞終濃度約為108個/mL)。藍(lán)藻細(xì)胞數(shù)的粗略計算公式:藍(lán)藻細(xì)胞濃度(cells/mL)=OD665×4.5 ×107;③接合轉(zhuǎn)移:將藻細(xì)胞與細(xì)菌按1∶10的比例混合均勻，輕輕地將其涂于無抗生素的固體培養(yǎng)基上，盡量使濾膜上的混合液均勻。正置平板1 h，使液體完全滲入培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)1～2 d，使藍(lán)藻表達(dá)抗性，小心轉(zhuǎn)移濾膜到含有相應(yīng)抗生素(以50、100、150、200、250、300 mg/L的濃度梯度逐級遞增卡那霉素的濃度)的平板上，繼續(xù)光照培養(yǎng)。約2周后，出現(xiàn)陽性克隆。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因藻的分子檢測 提取2種轉(zhuǎn)基因魚腥藻 pRL-PsbA-GCSF、pRL-Tac-GCSF質(zhì)粒DNA，然后以質(zhì)粒DNA為模板，用GCSF上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測轉(zhuǎn)基因藻中GCSF基因的存在。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因藻的RT-PCR 提取藍(lán)藻總RNA，利用Trizol法分別提取野生型魚腥藻7120，轉(zhuǎn)基因型pRL-tac-GCSF(非誘導(dǎo))，轉(zhuǎn)基因型pRL-tac-GCSF(1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)12 h)，轉(zhuǎn)基因型pRL-psbA-GCSF的總RNA，用DNAse除去基因組DNA后，分別用rnpB上、下游和G-CSF上、下游進(jìn)行PCR。具體方法見PT-PCR使用說明書。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因藻蛋白的Elisa檢測 取40 mL處于對數(shù)生長后期的野生型藍(lán)藻PCC 7120、轉(zhuǎn)基因型pRL-tac-GCSF(非誘導(dǎo))、轉(zhuǎn)基因型 pRL-tac-GCSF(1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)12 h)和轉(zhuǎn)基因型pRL-psbA-GCSF藻液于離心管中，4000 r/min離心5 min收集藻細(xì)胞，棄上清，用裂解緩沖液洗滌2～3次，加入適量裂解液，－80℃、室溫反復(fù)凍融6次，超聲，12000 r/min離心5 min，收集上清，即為粗提蛋白。方法見人粒細(xì)胞集落刺激因子定量酶聯(lián)檢測試劑盒使用說明書。注意取等量(100 μg)總蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建

為了獲得Ptac啟動子，以PGEX表達(dá)載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約100 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。測序結(jié)果表明該片段長度為109 bp，與從文獻(xiàn)中查閱的Tac序列比對，相似度為100%，說明序列完全正確。構(gòu)建的穿梭表達(dá)載體pRL-tac-G-CSF(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，酶切鑒定，篩選陽性克隆。

2.2 轉(zhuǎn)基因藻的獲得

圖1 穿梭表達(dá)載體pRL-tac-G-CSF的構(gòu)建Fig.1 Scheme for construction of the shuttle expression vector pRL-tac-G-CSF

利用三親接合轉(zhuǎn)移［14］，將穿梭表達(dá)載體pRL-489、pRL-PsbA-GCSF和pRL-tac-G-CSF分別轉(zhuǎn)入魚腥藻7120，在含卡那霉素的BG11固體平板上進(jìn)行篩選。2周后，含質(zhì)粒 pRL-489、pRL-PsbAGCSF和pRL-tac-G-CSF的魚腥藻7120在膜上長出藻落(圖2)，而野生藻在抗生素壓力下死亡。這一結(jié)果初步表明，質(zhì)粒 pRL-489、pRL-PsbAGCSF和pRL-tac-G-CSF已分別轉(zhuǎn)入魚腥藻7120中，需進(jìn)一步確認(rèn)。

圖2 轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的篩選Fig.2 Screening of the transgenic Anabaena sp.PCC 7120

2.3 轉(zhuǎn)基因藻的分子檢測

圖3 轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的PCR檢測Fig.3 Identification of PCR products in transgenic Anabaena sp.PCC 7120

提取2種轉(zhuǎn)基因魚腥藻 pRL-PsbA-GCSF、pRL-Tac-GCSF質(zhì)粒DNA，然后以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示，2種轉(zhuǎn)基因魚腥藻的質(zhì)粒DNA能擴(kuò)增出500 bp以上的G-CSF基因(圖3)，可初步斷定基因轉(zhuǎn)化成功。為了排除PCR非特異擴(kuò)增的干擾，將轉(zhuǎn)基因型藍(lán)藻擴(kuò)增出的條帶純化后，以hG-CSF上游引物作為測序引物，送上海生工測序。將測序結(jié)果與hG-CSF基因BLAST，證實(shí)確實(shí)為hG-CSF基因，因此，獲得2種啟動子驅(qū)動的hG-CSF轉(zhuǎn)基因藻。

2.4 轉(zhuǎn)基因藻的RT-PCR

為了檢測轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻中hG-CSF的轉(zhuǎn)錄水平，使用一步半定量RT-PCR方法檢測mRNA轉(zhuǎn)錄水平。提取藍(lán)藻總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見，所提RNA條帶清楚，但含有部分基因組DNA(圖4A)，會對后續(xù)的RT-PCR造成干擾;用DNAse除去基因組DNA后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見DNA除盡 (圖4B)，可用于RT-PCR。用 Random 6mers引物逆轉(zhuǎn)錄后，用rnpB基因作為內(nèi)參，確保所用樣品具有相同量的RNA，rnpB上、下游引物PCR后電泳，如圖4C，條帶亮度一致，可確定模板RNA用量一致。用G-CSF上、下游引物進(jìn)行PCR，電泳，如圖4D。結(jié)果以內(nèi)參條帶為參考經(jīng)Qality ONE軟件分析，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明2種含hG-CSF的轉(zhuǎn)基因藻均能轉(zhuǎn)錄 hG-CSF，但二者的轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著。

圖4 轉(zhuǎn)基因藻的RT-PCR結(jié)果Fig.4 The hG-CSF transcription level in transgenic Anabaena sp.7120 measured by RT-PCR method

2.5 轉(zhuǎn)基因藻蛋白的ELISA檢測

圖5 轉(zhuǎn)基因藻蛋白的ELISA分析Fig.5 Elisa analysis of the amount of hG-CSF protein in transgenic Anabaena sp.PCC 7120

為了進(jìn)一步比較2種啟動子在藍(lán)藻中的最終作用效果，使用酶聯(lián)免疫方法測定目的蛋白的表達(dá)量，結(jié)果見圖5。由圖5可知，7120-Tac-CSF在不誘導(dǎo)的條件下(Tac-)，其表達(dá)量與野生型(7120)沒有區(qū)別，即可認(rèn)為是沒有hG-CSF表達(dá)，誘導(dǎo)條件下表達(dá)量有上升趨勢，7120-PsbA-CSF比Tac啟動子在誘導(dǎo)條件下驅(qū)動的基因表達(dá)量高1.17 倍。

3 討論

1980年以來，藍(lán)藻基因工程快速發(fā)展，但其應(yīng)用一直局限于理論研究，表達(dá)效率低是其發(fā)展瓶頸之一。近幾年，藍(lán)藻作為最理想的合成生物學(xué)底盤細(xì)胞之一引起了人們對藍(lán)藻基因工程的廣泛關(guān)注，但由于對藍(lán)藻表達(dá)載體研究較少，缺少像大腸埃希菌那樣豐富的表達(dá)載體成為其發(fā)展的局限因素［15-16］，因此，對藍(lán)藻基因表達(dá)元件及系統(tǒng)的研究尤其重要。

自1984年適用于接合轉(zhuǎn)移的可在大腸埃希菌與藍(lán)藻間穿梭表達(dá)的pRL載體構(gòu)建完成［7］至今，殺蚊幼蟲毒素蛋白、人的超氧化歧化酶、腫瘤壞死因子等大批外源基因已在藍(lán)藻中成功表達(dá)［3］。然而，藍(lán)藻基因工程產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程并不順利，究其原因，外源重組蛋白表達(dá)效率低下可能是關(guān)鍵因素之一。近20年人們在轉(zhuǎn)錄、翻譯及培養(yǎng)等方面進(jìn)行了大量的研究工作，特別是對啟動子的研究，推動了藍(lán)藻基因工程的進(jìn)展［17］。對于用于藍(lán)藻中表達(dá)外源基因的啟動子的研究，內(nèi)源性的啟動子有:光調(diào)節(jié)的 PsbA、cpcBA，溫度調(diào)節(jié)cpcB1A1、PRPL，外源性的啟動子有 IPTG誘導(dǎo)的Ptac、Ptrc，T7聚合酶識別的T7啟動子，其中表達(dá)效率較高的啟動子認(rèn)為是IPTG誘導(dǎo)的Ptac和PsbA，本研究在最優(yōu)IPTG誘導(dǎo)條件的結(jié)果說明PsbA的表達(dá)效率稍高于Ptac。由于利用Ptac可以比較容易通過添加誘導(dǎo)劑調(diào)整基因的表達(dá)水平，因此用于研究基因功能有較強(qiáng)的優(yōu)勢，本研究結(jié)果也表明，不加誘導(dǎo)劑的情況下，檢測不到hGCSF的表達(dá)量，說明組成型表達(dá)極低。如果考慮工業(yè)應(yīng)用，由于不需添加任何外源化學(xué)物質(zhì)，藍(lán)藻生長本身需要光照，光誘導(dǎo)的PpsbA啟動子是理想的選擇。

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