楊 柳，葉 菁，陳小燕，許敬亮*，袁振宏

(1.中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039;3.華中科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430074)

利用廉價(jià)、儲(chǔ)量豐富的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)液體燃料，對(duì)于解決當(dāng)前能源危機(jī)和環(huán)境污染具有重大意義。木質(zhì)纖維原料經(jīng)預(yù)處理和水解后會(huì)產(chǎn)生大量的葡萄糖和木糖［1-2］，其中木糖比重最高可達(dá)20%，然而自然界中的微生物普遍不能以木糖作為發(fā)酵底物，這一問題已成為發(fā)展木質(zhì)纖維原料生物煉制的主要瓶頸［3-4］。谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)是當(dāng)前氨基酸和核酸工業(yè)的主要生產(chǎn)菌株，在細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的狀態(tài)下，仍能大量合成乳酸、琥珀酸等高附加值產(chǎn)物，且對(duì)木質(zhì)纖維原料預(yù)處理過程中產(chǎn)生的抑制物具有良好的耐受性，但目前分離出的谷氨酸棒桿菌都由于缺失木糖異構(gòu)酶的編碼基因xylA而不能代謝木糖［1，5］。由此，本實(shí)驗(yàn)通過基因工程手段，將大腸埃希菌 MG1655的xylA基因重組到大腸埃希菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體 pECXK99E上，并通過敲除其上編碼對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起負(fù)調(diào)控作用的 lacIq，使得 xylA在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中能組成型表達(dá)［6］，以期為今后微生物利用木糖代謝研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)中用到的菌株、質(zhì)粒及其相關(guān)特性見表1。

表1 菌株及質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸埃希菌LB培養(yǎng)基(w/v):胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%;谷氨酸棒桿菌LBG培養(yǎng)基為添加了0.5%葡萄糖的LB培養(yǎng)基。谷氨酸棒桿菌感受態(tài)的制備所用培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)［7-8］。固體培養(yǎng)基添加2.2%瓊脂。

1.1.3 酶及試劑 D-木酮糖、溶菌酶、三氯乙酸X-gal、IPTG、卡那霉素、氨芐青霉素購自 SIGMA;KOD-plus Taq DNA聚合酶購自Toyobo公司;Taq DNA Polymerase高溫聚合酶以及其他PCR相關(guān)試劑購自上海生工生物工程有限公司;T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或者進(jìn)口分析純或生化級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已報(bào)道的大腸埃希菌 MG1655 xylA基因序列(Gene ID:948141)，利用 Primer Premier 5.0 和 Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)PCR引物，并在基因片段的兩端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)(圖中下劃線部分)。

1.2.2 基因提取與PCR反應(yīng)程序 本實(shí)驗(yàn)中基因組提取采用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒;質(zhì)粒提取采用QIAprep Spin Miniprep Kit，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。以大腸埃希菌MG1655基因組為模板，按照Phusion Hot StarⅡDNA高保真酶的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件:98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)數(shù)35次。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 大腸埃希菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體pEC-XK99E［9-10］的質(zhì)粒圖譜如圖1所示。先利用其上的EcoRⅤ和NdeⅠ酶切位點(diǎn)敲出 lacIq基因，得到改造載體 pEC-XK99E(lacI－)。再將經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切的xylA基因片段與用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切的載體pEC-XK99E(lacI－)進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pEC(lacI－)-xylA。

圖1 表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of expression vector

1.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及檢測(cè) 將構(gòu)建好的載體pEC(lacI－)-xylA同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 BL21和谷氨酸棒桿菌 ATCC13032，并以空載體pEC-XK99E(lacI－)作為對(duì)照。大腸埃希菌 BL21的轉(zhuǎn)化方法參考TransGen生物技術(shù)公司的操作步驟，谷氨酸棒桿菌ATCC13032感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化參考文獻(xiàn)［7-8］。以含卡那霉素終濃度為50 μg/mL的平板為篩選條件，挑選菌株通過酶切和PCR驗(yàn)證是否為陽性克隆子。

1.2.5 木糖異構(gòu)酶的表達(dá)與酶活測(cè)定 取過夜培養(yǎng)的菌液2 mL，4℃下5000×g離心5 min，收集菌體。重懸液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管，置于冰水浴中進(jìn)行超聲破碎。超聲處理時(shí)，將變幅桿(型號(hào)φ2)沒于液面和管底中間，超聲功率80 W，處理5 s間歇5 s直至重懸液變澄清，重復(fù)該過程5～10 min。將超聲處理后的菌懸液4℃下20000×g離心30 min，收集上清液，轉(zhuǎn)入干凈離心管中，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。由于谷氨酸棒桿菌是革蘭陽性菌，較難破壁，因此菌體用雙蒸水洗滌2次后，加入1 mL溶菌酶液，37℃處理1 h后再進(jìn)行超聲波破碎。將上述獲得的粗酶液通過半胱氨酸-咔唑法測(cè)定木糖異構(gòu)酶(XI)活性［11-12］。木糖異構(gòu)酶酶活單位定義:在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每10 min催化產(chǎn)生1 μmol D-木酮糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位(即1 U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 xylA基因PCR產(chǎn)物

以大腸埃希菌 MG1655基因組為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有特異的單一條帶(圖2)，大小與理論值1412接近，經(jīng)測(cè)序比對(duì)基因序列正確。

圖2 xylA基因PCR產(chǎn)物Fig.2 Product of PCR for xylA gene

2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

2.2.1 pEC-XK99E(lacI－)構(gòu)建 切除大腸埃希菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體pEC-XK99E上編碼對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起負(fù)調(diào)控作用的lacIq基因，使得xylA在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中能組成型表達(dá)，促進(jìn)目的基因的表達(dá)。改造載體pEC-XK99E(lacI－)經(jīng) NcoI、HindⅢ雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小正確，產(chǎn)生3個(gè)片段(圖3a)，位置大小與理論值相同2817、1247和1769 bp接近，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2.2 表達(dá)質(zhì)粒 pEC(lacI－)-xylA構(gòu)建 表達(dá)質(zhì)粒pEC(lacI－)-xylA經(jīng) EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小正確，約為5840和1402 bp(圖3b)，經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析表明表達(dá)載體構(gòu)建成功，所得質(zhì)粒為目的載體pEC(lacI－)-xylA。

圖3 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 The result of pamsid digested with restriction enzyme

2.3 蛋白質(zhì)電泳及酶活測(cè)定結(jié)果

2.3.1 xylA基因在大腸埃希菌中表達(dá) 大腸埃希菌木糖異構(gòu)酶的亞基分子量為44 ku［13］。如圖4所示，在樣品總蛋白含量基本一致的條件下，相較于對(duì)照組的重組菌株粗酶液，表達(dá)載體pEC(lacI－)-xylA的轉(zhuǎn)化子在蛋白質(zhì)Marker 44.3 ku附近的條帶明顯加粗，表明xylA基因在重組子中表達(dá)，隨后的木糖異構(gòu)酶酶活測(cè)定結(jié)果也證明了這一點(diǎn)(表 2)。重組菌株 BL21(pEC(lacI－)-xylA)在2種培養(yǎng)條件下都具有木糖異構(gòu)酶酶活，且培養(yǎng)過程中沒有添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子酶活相對(duì)較高(1.481 U/mg蛋白)，這表明xylA基因在E.coli重組菌株中能組成型表達(dá)。

圖4 E.coli BL21陽性轉(zhuǎn)化子SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of reconbinant strain E.coli BL21

表2 E.coli BL21陽性轉(zhuǎn)化子XI酶活測(cè)定結(jié)果Table 2 The XI actvity of E.coli BL21 reconbinant strain

2.3.2 xylA基因在谷氨酸棒桿菌中表達(dá) 經(jīng)菌落PCR證明xylA基因已成功轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌(圖5)，但隨后的蛋白質(zhì)電泳和酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，xylA基因并沒有在谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032中表達(dá)或表達(dá)痕量無法檢測(cè)。在后面的工作中，對(duì)該載體進(jìn)行了啟動(dòng)子改造，研究結(jié)果另文發(fā)表。

圖5 C.glutamicum ATCC 13032轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 PCR identification of reconbinant strain C.glutamicum ATCC 13032

3 討論

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了木糖異構(gòu)酶表達(dá)載體pEC(lacI－)-xylA。但是通過誘導(dǎo)表達(dá)，僅在大腸埃希菌中表現(xiàn)活性。造成外源基因xylA在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032和大腸埃希菌BL21中表達(dá)差異的主要原因:①啟動(dòng)子強(qiáng)度:原核基因的啟動(dòng)子通常具有一些特定的結(jié)構(gòu)保守區(qū)，它們的堿基組成以及之間的距離會(huì)在很大程度上影響啟動(dòng)子的強(qiáng)度，從而控制目的基因轉(zhuǎn)錄水平的高低［14］。本文所采用的啟動(dòng)子Ptrc為大腸埃希菌的強(qiáng)啟動(dòng)子［15］，而與目前預(yù)測(cè)的谷氨酸棒桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子區(qū)域的序列模式［16-18］有所區(qū)別，極有可能導(dǎo)致外源基因在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)痕量;②核糖體結(jié)合位點(diǎn):翻譯起始的效率是影響基因表達(dá)水平的另一重要因素。核糖體結(jié)合位點(diǎn)選用不當(dāng)，會(huì)使目的基因5'端形成“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)，從而阻礙mRNA 5'端與核糖體30S亞基的結(jié)合，抑制翻譯的起始［14，19］;③質(zhì)?？截悢?shù):一般而言，質(zhì)?？截悢?shù)與目的基因編碼產(chǎn)物之間在一定閾值內(nèi)呈非線性的正比關(guān)系，因此質(zhì)?？截悢?shù)的增加可使目的蛋白產(chǎn)量提高。相比大腸埃希菌而言，穿梭載體pECXK99E在谷氨酸棒桿菌中的拷貝數(shù)較低，這對(duì)xylA基因的表達(dá)量也有一定影響［20-21］。

未來在關(guān)于木糖異構(gòu)酶基因在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)結(jié)構(gòu)的研究中，可以優(yōu)先考慮使用谷氨酸棒桿菌自身的強(qiáng)啟動(dòng)子序列［16-18］，并結(jié)合有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，促使外源基因在谷氨酸棒桿菌中快速有效地表達(dá)。

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