鄭苗苗，焦戰(zhàn)戰(zhàn)，張令昂，邵淑麗，翟 瑩

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

漆酶(laccase)是一種含銅的多酚氧化酶，屬于氧化酶的藍銅家族。含有4個銅原子，分別位于3個不同結合位點，并且高度保守［1］。1883年由日本吉田在漆樹中發(fā)現(xiàn)漆酶，1893年Laborde在真菌中發(fā)現(xiàn)了漆酶?，F(xiàn)在已證實漆酶普遍存在于細菌、真菌、植物、昆蟲中［2］，其中真菌中白腐菌是最重要的漆酶生產菌［3］。漆酶能夠催化許多芳香族化合物并有廣泛的作用底物，具有很大的實際應用價值。近年來，漆酶在造紙工業(yè)［4］、食品工業(yè)［5］等領域得到了深入的研究和廣泛應用，尤其是在環(huán)境保護方面更是研究的熱點，如環(huán)境中有毒有害物質的降解［6］、染料脫色［7］及土壤中雜酚油類物質的去除［8］等，對于環(huán)境污染物的消除起著很大作用。本文選用白腐真菌紅平菇Pleurotus djamor為材料，對該菌株產漆酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，從而獲得最佳產漆酶條件，優(yōu)化后的粗酶液應用于合成染料的脫色，進而對環(huán)境污染防治具有理論指導意義和廣泛的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 紅平菇Pleurotus djamor購自福建三明真菌研究所，由齊齊哈爾大學微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DMP(2，6-Dimethoxyphenol)、ABTS(2，2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic))購自Sigma公司，其余有機及無機試劑為國產分析純試劑。供試染料由齊齊哈爾大學微生物實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，馬玲薯200，瓊脂 20，KH2PO43.0，MgSO41.5，pH值自然;產酶初始培養(yǎng)基:低氮天冬酰胺-琥珀酸培養(yǎng)基(Low Nitrogen Asparagine Succinicacid，LNAS)［9-10］，是一種營養(yǎng)成分有限的初始產酶培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均在1×105Pa滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 產酶培養(yǎng)方式 在錐形瓶中加入70 mL LNAS基礎培養(yǎng)基，然后各加入4種不同底物進行菌絲培養(yǎng):A、LNAS培養(yǎng)基不含Cu2+，即礦物元素溶液中不添加CuSO4·H2O;B、LNAS培養(yǎng)基含Cu2+(2.5 ×10－3mmol/L)，即礦物元素溶液中添加 CuSO4·H2O;C、LNAS 培養(yǎng)基含 Cu2+(2.5 ×10－3mmol/L)，并加入 10 mmol/L 2，6-二甲氧基苯酚(2，6-DMP)0.1 mL 為產酶底物;D、LNAS 培養(yǎng)基含 Cu2+(2.5 ×10－3mmol/L)，并加入 2 g青楊木屑為產酶底物。接菌前向每個錐形瓶中加入5 mL的15%葡萄糖溶液。將保藏在PDA培養(yǎng)基上的紅平菇菌種，用打孔器在菌絲邊緣進行打孔，將菌餅轉接至錐形瓶中，26℃靜止培養(yǎng)，每項試驗設3個重復。培養(yǎng)3 d后，每隔1 d提取胞外酶液，一直測到第21天，將提取的粗酶液離心后取上清進行酶活測定。

1.2.2 漆酶活力的測定 分光光度計檢測漆酶在420、470、310 nm下與底物在25℃反應1 min的吸光度，計算漆酶活性。酶活單位(U/L):1 min催化1 μmol ABTS所消耗的酶量。計算中的ε420=36000 mol·L－1·m－1、ε470=49600 mol·L－1·cm－1、ε310=9300000 mol·L－1·cm－1。計算酶活值后繪制出產酶活時間曲線圖，測定吸光度體系為:空白對照管中加2.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 3.4)和50 μL稀釋后的酶液;檢測管中加1.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 3.4)，50 μL 稀釋后的酶液，1 mL 1 mmol/L ABTS。所有測量均重復3次取平均值。

1.2.3 染料及脫色率 染料:SN4R:杭州方順化工有限公司;甲基橙:沈陽市新光化工廠公司;孔雀綠:上海撫生實業(yè)有限公司;中性紅:天津市大茂化學試劑廠。利用紫外可見分光光度計在300～800 nm區(qū)間掃描，得到在此區(qū)間4種染料的最大吸收峰值:孔雀綠558 nm，Abs=3.511;中性紅527 nm，Abs=3.514;甲基橙486 nm，Abs=1.876;SN4R 432 nm，Abs=0.659。重組酶液、4 種染料(40 mg/L)和50 mmol/L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液總體積為3 mL，間隔一定時間檢測4種染料的吸光度值，得到吸光度為A1;對照中加入等量的含空質粒酶液，測得其吸光度為A0。染料脫色率計算:

2 結果與分析

2.1 紅平菇在不同培養(yǎng)液中漆酶酶活性變化

在21 d的培養(yǎng)過程中，不同培養(yǎng)液中漆酶酶活性大小不同，結果見圖1。A、不含Cu2+培養(yǎng)液:在不含Cu2+的LNAS培養(yǎng)基不加底物條件下，提取的酶液可以檢測到的漆酶的活性，活性很低，在第9天達到最大酶活力僅為66.5 U/L。B、含Cu2+培養(yǎng)液:在含Cu2+的LNAS培養(yǎng)基中不加底物條件下，提取的酶液可以檢測到漆酶的活性，也在第9天時達最大分泌量，酶活力達235.4 U/L。C、含 Cu2+加入 2，6-DMP培養(yǎng)液:在含 Cu2+的LNAS培養(yǎng)基中加入2，6-DMP為底物的條件下，提取的酶液也檢測到漆酶的活性變化，在第9天達到最大分泌量，酶活力為253.4 U/L。D、含Cu2+加入木屑培養(yǎng)液:在含Cu2+的LNAS培養(yǎng)基中加入木屑為底物條件下，提取的酶液檢測到漆酶的活性變化，漆酶在第9天達到最大分泌量，酶活力為458.8 U/L。以木屑為底物漆酶的分泌量要高于以2，6-DMP為底物的漆酶產生量，其吸收峰在420 nm處有明顯的峰值變化。

圖1 紅平菇在不同培養(yǎng)液中漆酶酶活變化Fig.1 Pleurotus djamor laccase enzyme activity changes in different cultures

2.2 漆酶對染料脫色結果

于含有CuSO4培養(yǎng)液中加入木屑，培養(yǎng)到第9天，將發(fā)酵液于8000 r/min離心6 min，取上清液，分別對SN4R、甲基橙、孔雀綠和中性紅4種染料的脫色能力進行測定，見圖2。

圖2 粗酶液對4種染料脫色率比較Fig.2 Crude enzyme solution of four kinds of dye r D/%

結果表明，紅平菇漆酶對4種染料具有脫色能力，并且脫色效果均不相同。對偶氮類孔雀綠在6 h時脫色率為87.5%，蒽醌類SN4R在24 h時脫色率為49.4%，偶氮類甲基橙在24 h時脫色率為45%，雜環(huán)類中性紅在24 h時脫色率為23.6%。因此，顯示出紅平菇漆酶對孔雀綠染料脫色具有較大的應用潛力，進而對廢水處理具有更好的應用前景。

3 討論

在4種不同培養(yǎng)基中，紅平菇漆酶在第3天開始分泌，隨后迅速升高，在第9～11天分泌量達到最高，之后迅速下降，到第15天趨向消失。通過A、B兩種培養(yǎng)液的檢測表明，漆酶的分泌量受Cu2+影響較大，Cu2+是紅平菇產漆酶的必要因子，在含Cu2+的LNAS培養(yǎng)基中漆酶的活性明顯提高。肖楚等［11］也證明Cu2+對漆酶活性有明顯的促進作用，但漆酶活性大小低于本試驗菌種，可以應用到漆酶工業(yè)化生產領域。通過C、D兩種培養(yǎng)液的檢測表明，在培養(yǎng)過程中添加2，6-DMP和木屑為底物均可提高漆酶的分泌量，證明不同底物對紅平菇產漆酶起到誘導作用。Pseudotrametes gibbosa和Grifola frondosa在培養(yǎng)過程中添加2，6-DMP和木屑為底物，漆酶活性提高［12-13］，但與本實驗相比漆酶活性較低，可能與Cu2+誘導有關，而其他3種培養(yǎng)方式的漆酶吸光度和吸收峰表現(xiàn)為不明顯的變化。

紅平菇漆酶對SN4R、甲基橙、孔雀綠和中性紅4種染料都具有脫色能力，在5 U/mL的酶活力下，6 h時對孔雀綠脫色效果就達到87.5%。Myrothecium verrucaria來源的漆酶對孔雀綠脫色效果為66.9%［14］。Chaetomium sp.R01 來源的漆酶對孔雀綠脫色效果為26%［15］。顯示了紅平菇漆酶對孔雀綠脫色效果要好于已發(fā)表的其他白腐真菌來源的漆酶，期望在工業(yè)生產中發(fā)揮重要作用［16］。

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