杜敬彩，曹春蕾，趙 剛，趙運(yùn)英，蔣伶活

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

鈣離子是生物的一種必需營(yíng)養(yǎng)因子，可以調(diào)控生長(zhǎng)、繁殖和程序性細(xì)胞死亡，以及心臟的肌肉收縮和口中的味覺(jué)［1］。鈣穩(wěn)態(tài)(Homeostasis)和鈣調(diào)磷酸酯酶信號(hào)途徑在真核細(xì)胞中是高度保守的。例如，酵母細(xì)胞中鈣通道(Channel)，鈣泵(Pump)和鈣交換器(Exchanger)在哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞中均有對(duì)等的同功蛋白，且作用方式基本相似［2］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母CRZ1的同功蛋白是T細(xì)胞中激活的核因子(Nuclear factor activated in T cells，NFAT)，它被鈣調(diào)磷酸酯酶激活后，調(diào)控細(xì)胞分化、心臟發(fā)育、受精作用、記憶和肌肉收縮［3］。細(xì)胞中鈣穩(wěn)態(tài)是被嚴(yán)格調(diào)控的，細(xì)胞質(zhì)中鈣濃度被保持在一個(gè)最佳的濃度。在外界不同鈣離子環(huán)境下，釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子濃度一般維持在50～200 nmol/L［2］。鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控是通過(guò)質(zhì)膜和細(xì)胞器膜上的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體(Transporter)和鈣泵的共同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的［4］。在釀酒酵母中，細(xì)胞外鈣離子通常通過(guò)未知的轉(zhuǎn)運(yùn)體“X”和“M”進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［7］。質(zhì)膜上的鈣通道(由 CCH1、MID1和ECM7)組成，控制鈣離子流入細(xì)胞質(zhì)，以應(yīng)答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和信息素(Pheromone);而哺乳動(dòng)物細(xì)胞TRP通道的同源蛋白—酵母液泡膜蛋白YVC1可以從液泡釋放鈣離子到細(xì)胞質(zhì)中，以應(yīng)答低滲休克(Hypotonic shock)［5］。細(xì)胞質(zhì)中鈣離子的瞬間升高可以適當(dāng)?shù)丶せ钼}/鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)途徑，從而誘導(dǎo)液泡膜上鈣泵基因pmc1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體膜上鈣泵基因pmr1的表達(dá)，這對(duì)細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界脅迫是至關(guān)重要的。然而，持續(xù)的細(xì)胞質(zhì)鈣離子積累對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是有害的。過(guò)多的細(xì)胞質(zhì)鈣離子通常通過(guò)PMC1鈣泵和Ca2+/H+交換器VCX1被引入液泡，以及被PMR1鈣泵引入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體中［6］。

最近，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)人體溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC10家族成員SLC10A7的白念珠菌同系物CaRCH1［7］。CaRCH1 的功能與白念珠菌對(duì)鈣離子、鋰離子和唑類藥物的耐受性有關(guān)，負(fù)調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)。釀酒酵母中也存在一個(gè)與SLC10A7同源的基因ymr034c，之前的轉(zhuǎn)座子突變篩選研究認(rèn)為ymr034c與唑類藥物的抗性有關(guān)［8］。然而，目前為止未見(jiàn)有對(duì)ymr034c其他功能的報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)ymr034c是白念珠菌Carch1的同功基因，它們的氨基酸組成序列有52.7%同源性，因此將其命名為Scrch1。我們的初步研究發(fā)現(xiàn)，高鈣離子濃度條件下，ScRCH1-GFP定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。本研究對(duì)釀酒酵母基因組中編碼轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的223個(gè)基因進(jìn)行系統(tǒng)篩選，發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因與ScRCH1的表達(dá)和細(xì)胞質(zhì)膜定位有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所用到的釀酒酵母菌株有野生型BY4743(MATa/α ura3Δ0/ura3Δ0;his3Δ1/his3Δ1;leu2Δ0/leu2Δ0;lys2Δ0/LYS2;MET15/met15Δ0)和以BY4743為背景的釀酒酵母雙倍體單基因缺失株文庫(kù)(購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH 7.0。配置固體培養(yǎng)基時(shí)加入1.5%(w/v)的瓊脂粉;②YPD培養(yǎng)基:蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母提取物1%。配置固體培養(yǎng)基時(shí)加入2%(w/v)的瓊脂粉;③SD-Ura培養(yǎng)基:酵母氮源0.67%，葡萄糖2%，滅菌后加入過(guò)濾滅菌過(guò)的10×必需氨基酸混合母液(不含尿氨酸)。

1.1.3 試劑 基因克隆相關(guān)用限制性內(nèi)切酶和T4連接酶等試劑購(gòu)自NEB公司;酵母轉(zhuǎn)化用ssDNA、LiAc和 PEG 3350等試劑購(gòu)自 Sigma公司;Taq DNA聚合酶和Trans1-T1大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司;CaCl2等其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 PCR反應(yīng)儀(德國(guó)艾本德公司)、全溫?fù)u瓶柜(太倉(cāng)強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(日本日立公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、熒光顯微鏡(Nikon 80i)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 ScRch1-GFP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建首先通過(guò)PCR擴(kuò)增含有785 bp啟動(dòng)子序列和沒(méi)有終止密碼子的Scrch1基因ORF的一段DNA片段，PCR產(chǎn)物的大小為2087 bp，所用引物為Scrch1-F(CGTTCGACCCATATGTGTCC，下劃線為BamHⅠ位點(diǎn))和Scrch1-TAG(ACGC CCTTGGTTGT GTATATGG，下劃線為SphⅠ位點(diǎn))。然后，將這個(gè)片段克隆到pGFP33(Michael N.Hall，Switzerland贈(zèng)送)的BamHⅠ和SphⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建出ScRCH1-GFP融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pGFP33-ScRCH1。

1.2.2 酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化 挑取活化的酵母單菌落接種于3 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng);取1 mL菌液于離心管中，室溫下5000 r/min離心 30 s，棄上清;管中細(xì)胞用 100 μL OSB buffer(50 μL 1 mol/L LiAc，20 μL 1 mol/L DTT，6.75 μL 10 mg/mL ssDNA)預(yù)混液重懸;加入適量質(zhì)粒 DNA(200 ng ～2 μg)，160 μL 50%PEG，并充分混勻;于42℃水浴熱激30 min;取出離心管，室溫下5000 r/min離心30 s后，去上清，用500 μL滅菌水洗1次菌體，涂布于所需營(yíng)養(yǎng)選擇培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，挑取酵母轉(zhuǎn)化子，在SD-URA固體培養(yǎng)基上劃線純化得到的酵母轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 細(xì)胞預(yù)處理和熒光顯微鏡觀察 挑取帶有pGFP33-ScRCH1質(zhì)粒的酵母單菌落，接種到含有3 mL SD-URA液體培養(yǎng)基的試管中，30℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。分別取100 μL過(guò)夜培養(yǎng)液，加入到2份含有900 μL新鮮YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后向其中1份培養(yǎng)物加入終濃度為0.2 mol/L CaCl2，繼續(xù)培養(yǎng)2 h熒光顯微鏡下觀察ScRCH1-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位情況。每個(gè)樣品隨機(jī)選取大約有100～200個(gè)酵母細(xì)胞進(jìn)行觀察，拍攝DIC和熒光照片。每個(gè)菌株隨機(jī)選取2個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子做熒光定位實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 釀酒酵母基因組中編碼轉(zhuǎn)錄因子基因的生物信息學(xué)分析 釀酒酵母雙倍體單基因缺失株文庫(kù)包括大約4757個(gè)非必需基因的缺失株［9］。SGD數(shù)據(jù)庫(kù)(The Saccharomyces Genome Database)檢索結(jié)果顯示，這4757個(gè)非必需基因中，共有223個(gè)基因編碼轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等，它們共同調(diào)控細(xì)胞內(nèi)不同基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(表1)。

表1 編碼酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的223個(gè)非必需基因Table 1 List of the 223 nonessential yeast genes encoding transcription factors

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)cRch1-GFP亞細(xì)胞定位的影響

圖1 ScRch1-GFP在野生型(WT)菌株和6個(gè)雙倍體基因缺失菌株中的亞細(xì)胞定位(1000×)Fig.1 Subcellular localization of ScRCH1-GFP in the wild type and 6 mutant strains(1000 × )

在經(jīng)0.2 mol/L CaCl2處理的野生型酵母細(xì)胞中ScRCH1-GFP定位于細(xì)胞質(zhì)膜上(圖1)。為了研究Scrch1基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理，將ScRCH1-GFP質(zhì)粒導(dǎo)入到上述223個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的雙倍體單基因缺失株中。然后，利用熒光定位的方法檢測(cè)0.2 mol/L CaCl2處理前后 ScRCH1-GFP融合蛋白在細(xì)胞中的定位情況。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，在不外加鈣離子的YPD培養(yǎng)基中，野生型酵母細(xì)胞中沒(méi)有觀察到ScRCH1-GFP定位的信號(hào)(圖1左邊第1排)。同樣，在不外加鈣離子的YPD培養(yǎng)基中，222個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子基因的缺失株與野生型菌株一樣都沒(méi)有ScRCH1-GFP的細(xì)胞質(zhì)膜熒光定位(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果顯示，未經(jīng)鈣離子處理時(shí)，這223個(gè)基因中唯一1個(gè)基因ino2的缺失株中，ScRCH1-GFP已經(jīng)定位到細(xì)胞質(zhì)膜上(圖1左邊第4排)。

0.2mol/L CaCl2處理2 h后，野生型酵母細(xì)胞中ScRCH1-GFP定位到了細(xì)胞質(zhì)膜上(圖1左邊第1排)。相比之下，這223個(gè)基因中有5個(gè)基因ngg1、hal9、crz1、ada2和 swi6的單基因缺失株細(xì)胞中，沒(méi)有觀察到ScRCH1-GFP的細(xì)胞質(zhì)膜熒光定位(圖1左邊第2～3排，右邊第1～3排)，但是ino2的單基因缺失株細(xì)胞中，ScRCH1-GFP的仍然定位在細(xì)胞質(zhì)膜上(圖1左邊第4排)。

3 討論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，編碼釀酒酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的 ino2、ngg1、ada2、hal9、crz1 和 swi6 六個(gè)基因的缺失影響了ScRCH1-GFP的正常細(xì)胞質(zhì)膜熒光定位，它們?cè)诩?xì)胞中的已知調(diào)控功能不同(表2)。ino2是異源二聚體轉(zhuǎn)錄激活因子 INO2/INO4螺旋-環(huán)-螺旋的組分，通過(guò)與肌糖/膽堿-響應(yīng)元件(ICREs)結(jié)合調(diào)節(jié)磷脂生物合成相關(guān)基因的表達(dá)［10］。但是，在 Scrch1啟動(dòng)子上沒(méi)有找到INO2的結(jié)合位點(diǎn)ICRE序列，因此，INO2不可能直接調(diào)控Scrch1的表達(dá)。ScRCH1是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，它的細(xì)胞質(zhì)定位也許與磷脂有關(guān)，推測(cè)INO2調(diào)控ScRCH1的胞質(zhì)定位可能是間接通過(guò)調(diào)控磷脂生物合成相關(guān)基因來(lái)完成的。NGG1也被稱為ADA3，是3個(gè)修飾染色質(zhì)的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)復(fù)合物SAGA、SLIK和ADA的組分之一，這3個(gè)復(fù)合物的催化亞基為GCN5，可以正向和負(fù)向調(diào)控一系列由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的基因的表達(dá)［11］。NGG1的C-端和ADA2相互作用形成 NGG1-ADA2-GCN5復(fù)合物［12］。我們還發(fā)現(xiàn)與NGG1存在同一個(gè)復(fù)合物中的ADA2，它也是3個(gè)復(fù)合物SAGA、SLIK和ADA的組分之一［11］，且發(fā)現(xiàn) ADA2和 NGG1在調(diào)控ScRCH1-GFP細(xì)胞質(zhì)膜定位方面的功能一致。由此可見(jiàn)，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物可能正向調(diào)控Scrch1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其功能的喪失可能導(dǎo)致Scrch1基因不能被轉(zhuǎn)錄，從而細(xì)胞內(nèi)不能合成ScRCH1蛋白，因此也就沒(méi)有細(xì)胞質(zhì)膜的定位。

HAL9是一個(gè)待證實(shí)的含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它的過(guò)表達(dá)可以增加Na+/Li+泵基因ena1的表達(dá)，從而提高細(xì)胞對(duì)Na+/Li+的耐受性［13］。推測(cè)HAL9對(duì)Scrch1基因的調(diào)控機(jī)理可能類似于它對(duì)ena1的調(diào)控。SWI6可以與SWI4和MBP1形成復(fù)合物在G1/S過(guò)渡期間調(diào)控轉(zhuǎn)錄，SWI6的核定位受細(xì)胞壁脅迫誘導(dǎo)的MPK1p磷酸化的調(diào)控［14］。SWI6對(duì)Scrch1基因的調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步研究。CRZ1是鈣離子激活的鈣調(diào)磷酸酯酶信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)基因啟動(dòng)子上的CDRE序列調(diào)控目的基因的表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)。在Scrch1啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)潛在的與CRZ1結(jié)合的CDRE序列，因此，CRZ1可能是直接調(diào)控Scrch1的表達(dá)?？傊?，這6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的發(fā)現(xiàn)為Scrch1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)，有助于對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)理的進(jìn)一步了解。

表2 與ScRCH1亞細(xì)胞膜定位有關(guān)的6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因Table 2 List of 6 transcriptional factor-encoding genes involved in ScRCH1 subcellular localization

續(xù)表

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