馬秀玲，陳蕊君，王 飛，徐騰月

(中國人民解放軍總后勤部 軍需裝備研究所，北京 100010)

微生物生長中細胞數(shù)量的測定主要有直接計數(shù)法(測定時需用細菌計數(shù)器或血球計數(shù)板，本法僅適于單細胞的微生物類群)、比濁法、稀釋平板計數(shù)法、液體稀釋培養(yǎng)計數(shù)法、濃縮法。在一定的濃度范圍內(nèi)，菌懸液中的微生物細胞濃度與液體的光密度(OD值)成正比，與透光度成反比，因此可以利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌懸液的濃度。由于細胞濃度僅在一定范圍內(nèi)與光密度呈線性關(guān)系，因此，待測菌懸液的濃度不宜過高或過低，過高會超過儀器的測量范圍并且細胞濃度與光密度不呈線性關(guān)系，同時要求培養(yǎng)液的顏色不宜過深，并盡量減少顆粒性雜質(zhì)的數(shù)量。該方法的優(yōu)點是快捷簡便，容易操作;缺點與麥氏比濁法相同，即難以區(qū)分活細胞與死細胞以及與微生物類似的雜質(zhì)。另外，形狀不規(guī)則的某些霉菌、放線菌，因菌懸液濃度并不能代表細胞數(shù)量，所以O(shè)D值和菌懸液濃度不成正比關(guān)系［1］。本實驗以大腸埃希菌為例，先用比濁法制成一定濃度的菌懸液，稀釋后得到不同稀釋度的菌懸液，再通過分光光度計測定不同濃度菌懸液的吸光度值，從而得到在某一濃度范圍內(nèi)菌懸液濃度與吸光度值的線性關(guān)系，同時應用稀釋平板法對菌落總數(shù)進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及試劑 大腸埃希菌(Escherichia coli，ATCC 25922)購于北京陸橋技術(shù)有限責任公司;平板計數(shù)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購于北京陸橋技術(shù)有限責任公司，均121℃高壓滅菌15 min后備用。

1.1.2 儀器 UV-2450紫外可見分光光度計(日本日立公司);LHZ-111落地式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜(濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司);LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

按照麥氏比濁法配制8×108cfu/g的菌懸液，再將其逐級稀釋至100 cfu/g，每個稀釋度在測定吸光度的同時用平板計數(shù)法測定其菌落總數(shù)。

1.2.1 待測菌液的制備 取1環(huán)在石蠟中保存的菌種以劃線法接種到平板計數(shù)培養(yǎng)基平板上，(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。取TSB培養(yǎng)基100 mL放入錐形瓶中，用接種環(huán)挑取上述平皿上的典型菌落接種在TSB錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為(36 ±1)℃、18 ～24 h，振動頻率 110 r/min［2］。

1.2.2 麥氏比濁法預估菌懸液濃度 配制稀釋液:取TSB培養(yǎng)基25 mL放入500 mL三角瓶中，再加475 mL無菌水混勻備用。無菌操作將被測定的TSB培養(yǎng)物加到與標準管相同直徑的無菌試管中［3］。以無菌操作向被測定試管加入稀釋液，然后在白紙上劃平行直線，直接用肉眼觀察(利用光在不同濃度液體中的折射不同)，直到濁度與所要求的標準管的濁度相同。

1.2.3 標準曲線的制作 制備好的菌懸液濃度大約為8×108cfu/g，取0.5 mL稀釋制備成4×108cfu/g菌懸液。以同樣的方式依次稀釋，直到稀釋至100 cfu/g，用UV-2450紫外可見分光光度計在波長600 nm［4］下，測量不同菌懸液的吸光度值。

1.2.4 菌落總數(shù)的測定 在無菌條件下，用1 mL移液管吸取不同稀釋度的菌懸液至無菌平皿中，每個稀釋度做2個平皿，同時分別吸取1 mL空白稀釋液加入2個無菌平皿內(nèi)做空白對照。及時用15～20 mL冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于(46±1)℃恒溫水浴保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，(36±1)℃培養(yǎng)24 h［5］。計數(shù)各平皿的菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)結(jié)果

測得的菌懸液平板計數(shù)結(jié)果及所對應的吸光度值見表1。

表1 不同濃度菌懸液的平板計數(shù)結(jié)果及所對應的吸光度值Table 1 The count results of bacterial suspension plate of different concentration and the corresponding absorbance values

由表1可見，菌懸液稀釋倍數(shù)較高時，吸光度值幾乎為零，直到平板菌落總數(shù)達到6×104cfu/g時，其對應菌懸液的吸光度值才開始出現(xiàn)明顯的變化。

2.2 標準曲線的繪制

用 6.0 ×104、1.2 ×105、6.0 × 105、1.2 × 106、6.0 ×106、1.2 ×107cfu/g 六個菌落總數(shù)的計數(shù)結(jié)果為橫坐標，用對應的菌懸液測定的吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，相關(guān)系數(shù)能達到0.9952。

圖1 菌落總數(shù)和吸光度值關(guān)系的標準曲線Fig.1 The standard curve between total numbers of colony and absorbance values

3 討論

試驗結(jié)果顯示，當菌落總數(shù)在63～1.2×104cfu/g之間時，菌懸液吸光度值變化很小;當菌落總數(shù)大于6×104cfu/g時，吸光度值變化明顯，因此利用分光光度計測定吸光度值確定菌懸液濃度方法不適用于菌落總數(shù)在105cfu/g以下的菌懸液。當菌落總數(shù)≥6×104cfu/g時，吸光度值與菌落總數(shù)呈強相關(guān)，R2=0.9952，因此用吸光度法確定菌懸液濃度時，宜在105～108cfu/g之間。

實驗中由麥氏比濁法預估的菌懸液濃度為8×108cfu/g，但實際測定的濃度為1.2×107cfu/g。原因是麥氏比濁法用肉眼直接觀察，并且培養(yǎng)基顏色偏黃，與標準管顏色不一致，所測菌懸液濃度與實際濃度之間有偏差。本實驗用吸光度法確定菌懸液濃度，并用平板計數(shù)法進行了驗證，方法更科學、更簡便。

［1］官小紅，楊俊，王庭欣，等.食品微生物學檢驗［M］.北京:中國計量出版社，2005:87-88.

［2］朱艷靜，李宇.測定菌體濃度的簡便方法［J］.工業(yè)微生物，2006，36(4):47-49.

［3］李瑾，劉振，何艷玲.微生物干粉培養(yǎng)基質(zhì)控圖解手冊［M］.北京:科學技術(shù)出版社，2007:3-5.

［4］熊海燕，王為國，王存文，等.介紹測量菌液濃度的一種方法［J］.四川食品與發(fā)酵，2003，(4):45-46.

［5］GB 4789.2-2010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定［S］.