莫顯文

【摘要】 梅毒這種慢性傳染病，不僅臨床表現(xiàn)復(fù)雜，而且病程長(zhǎng)，危害性大，長(zhǎng)期以來(lái)在臨床中無(wú)法完整的培養(yǎng)好蒼白密螺旋體，因而導(dǎo)致在臨床中以蒼白密螺旋體為基礎(chǔ)的抗原研究受到了極大的阻礙。近些年來(lái)隨著對(duì)蒼白密螺旋體基因研究的不斷深入，與蒼白密螺旋體基因相關(guān)的抗原研究也得了極大的發(fā)展。目前臨床中對(duì)于梅毒的診斷主要以血清學(xué)實(shí)驗(yàn)為主，掌握與其相關(guān)的血清學(xué)診斷方法，有利于梅毒的早發(fā)現(xiàn)、早治療。本文將對(duì)蒼白密螺旋體重組抗原以及與其對(duì)應(yīng)的血清學(xué)診斷的進(jìn)展做一個(gè)綜述。

【關(guān)鍵詞】 梅毒； 慢性傳染??； 蒼白密螺旋體； 血清學(xué)

Research Progress on Gene Recombinant Antigen of Treponema Pallidum （TP） and Its Serology Diagnosis/MO Xian-wen.//Medical Innovation of China，2014，11（28）：141-144

【Abstract】 Syphilis， a chtonic infectious disease， with complicated clinical manifestaion， long course and huge perniciousness， and complete treponema pallidum （TP） is unable to culture in clinical for a long time， which leads hinders in the antigen study based on TP. In latest years， with the constant and deeper study on the TP genes， it reached a big process that the study on related antigens of TP genes. The diagnosis of sphilis is based on serology currently， so it would be helpful for the treatment of syphilis that mastering related serology diagnosis. This paper is a summary about the research progress on gene recombinant antigen of TP and its serology diagnosis.

【Key words】 Syphilis； Chronic infectious disease； Treponema pallidum； Serology

First-authors address： Guidong Peoples Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Wuzhou 543001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.28.048

導(dǎo)致人體感染梅毒的致病菌為蒼白螺旋體的亞種-密螺旋體（TP），感染人體的主要致病菌株為Nichols株。梅毒螺旋體的細(xì)胞質(zhì)被3層細(xì)胞質(zhì)外膜包裹著，而暴露于外膜的跨膜蛋白數(shù)量較少，但跨膜蛋白在臨床中對(duì)于梅毒的診斷確診有著極大的實(shí)際價(jià)值[1]。在實(shí)際的臨床操作中，很難對(duì)梅毒螺旋體進(jìn)行體外培養(yǎng)，確診梅毒的方式由培養(yǎng)梅毒螺旋體替代為利用梅毒螺旋體的重組抗原進(jìn)行對(duì)應(yīng)的檢測(cè)。

1 梅毒螺旋體基因重組抗原的研究進(jìn)展

1.1 Tpr基因家族 Tpr基因家族涵蓋了12個(gè)蛋白，這12個(gè)蛋白按照同源性氨基酸的分類應(yīng)該屬于3個(gè)不同的亞型，其中Ⅰ亞型為Tpr C、D、F、I，Ⅱ亞型為Tpr E、G、J，Ⅲ亞型為A、B、H、L、K[2]。在這3個(gè)亞型中，在梅毒感染兔的模型中，誘導(dǎo)T細(xì)胞以及強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)的為Tpr K，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示著使用Tpr免疫能夠有效地減弱梅毒患者損傷后病情的進(jìn)一步發(fā)展。在分子結(jié)構(gòu)學(xué)上，對(duì)于Tpr家族的Ⅰ亞型而言，其中它們的C端和N端高度相似于F端和N端，特別是在Tpr的C、D兩個(gè)亞型之間，它們C端結(jié)構(gòu)的相似度高達(dá)94%[3]。在對(duì)Tpr家族的抗原氨基末端的重組性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這些抗原對(duì)于感染梅毒患者的損傷的進(jìn)展有著一定程度的減弱作用，這些重組抗原很可能起著關(guān)鍵作用的階段為梅毒患者的不完全免疫階段。

1.2 TpN15、TpN47、TpN17、TmpA 1989年有學(xué)者利用兔子的抗體血清成功的篩查出了Tp基因組中的6個(gè)重組克隆，且利用Western法以及電泳法成功的篩選出了TpN15、TmpA、TpN17等3個(gè)蛋白[4]。在1996年，相應(yīng)的學(xué)者在通過(guò)對(duì)梅毒螺旋體的結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，他們利用PCR法對(duì)梅毒螺旋體內(nèi)的基因進(jìn)行了擴(kuò)增，并將擴(kuò)增后的基因插入大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果獲得了TpN47、TpN35、TpN44.5、TpN29-35、TpN39等抗原，接下來(lái)的ELISA法實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)上述抗原中引起抗體滴度最高的為TpN47、TpN17、TpN44.5[5]。在后續(xù)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，學(xué)者重組并成功表達(dá)了TpN47的載體pGEX-2T，并成功證實(shí)了其具有免疫原性，同時(shí)有學(xué)者的相關(guān)實(shí)驗(yàn)還成功的證實(shí)了TpN47是一種能夠與青霉素進(jìn)行結(jié)合的蛋白，并且發(fā)現(xiàn)TpN47與青霉素結(jié)合的位點(diǎn)有3個(gè)，同時(shí)還證實(shí)TpN47本身是一種具有鋅依賴性的羧肽。有學(xué)者通過(guò)重疊多肽的方法成功的找出了位于TpN47上的抗原表位[6]。

1.3 TROMP TROMP對(duì)于梅毒具有免疫原性，而在TROMPs的表面可能存在著免疫宿主的介導(dǎo)區(qū)和致病力決定區(qū)，在TROMP的表面上存在著17-kDa、28-kDa、31-kDa、45-kDa、65-kDa。其中存在于TP內(nèi)膜原生質(zhì)體復(fù)合物中的主要為17-kDa和45-kDa，而存在于外膜的主要為28-kDa、31-KDa以及65-kDa[7]。在天然重組蛋白質(zhì)中，28-kDa、31-kDa、65-kDa就天然的具有抗原性質(zhì)，28-kDa主要在外膜中進(jìn)行表達(dá)，并且與跨膜蛋白存在著高度相似的序列，65-kDa其整體數(shù)量雖然較少，但是仍然被認(rèn)定為具有抗原免疫性，而31-kDa被證明具有能夠形成微管的能力，從而被間接的證實(shí)為跨膜蛋白。目前國(guó)外的相應(yīng)研究已經(jīng)明確，TP分子本身的免疫反應(yīng)能夠產(chǎn)生高滴度的TP抗體，在上述反應(yīng)過(guò)程中，TROMPs能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的抗體。在相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有自然的TP感染才能夠產(chǎn)生真正的血清吞噬作用，而使用滅活的Tp重組抗原并不能夠產(chǎn)生真正意義上的血清吞噬作用[8]。在對(duì)TROMP1的各項(xiàng)重組實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，在電子顯微鏡下可以明顯發(fā)現(xiàn)在Tp感染的血清中，TROMP1的表達(dá)主要是在重組菌的表面表達(dá)，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)還證實(shí)對(duì)于rTROMP1而言，其定位于E.coil的外膜，并且同時(shí)兼有表面抗原性以及微孔體系。endprint

1.4 Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453、Tp92 在1998年的實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)對(duì)于Tp92而言，其極有可能是Tp的抗原之一，并通過(guò)PET-3a T7載體重組表達(dá)了Tp92，通過(guò)對(duì)表達(dá)后的Tp92進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Tp92確實(shí)具有抗原免疫性[9]。Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453都是通過(guò)PCR擴(kuò)增法進(jìn)行了去除N端信號(hào)肽的全長(zhǎng)表達(dá)，且表達(dá)后的這6個(gè)蛋白均進(jìn)行了臨床血清學(xué)的檢測(cè)，最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于Tp0155、Tp0751、Tp0483而言，實(shí)驗(yàn)的靈敏度為28%～42%之間，而對(duì)于Tp0453而言，其中檢測(cè)的靈敏度和特異度均為100%，Tp92的特異度為97%、靈敏度為98%。其中學(xué)者描述了Tp0453的除去兩段端肽的結(jié)構(gòu)，但近些年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究則顯示，Tp0453的結(jié)構(gòu)目前與所有已知的外膜蛋白都不相同，Tp0453缺少一種β桶結(jié)構(gòu)，正是因?yàn)槿鄙龠@種結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Tp0453無(wú)法橫跨外膜，從而避免暴露于Tp的菌體外膜表面[10]。正是因?yàn)門p0453的這種結(jié)構(gòu)特殊性，有學(xué)者認(rèn)為對(duì)于Tp0453極有可能代表一大類的新的細(xì)菌外膜蛋白。國(guó)內(nèi)有學(xué)者新組了Tp0453并對(duì)其進(jìn)行了臨床評(píng)價(jià)，最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tp0453應(yīng)該可以被用于ELISA反應(yīng)[11]。

1.5 Tp4D以及TpN37 在1986年的國(guó)外學(xué)者的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)中就已經(jīng)證實(shí)，對(duì)于Tp4D而言，其確實(shí)具有抗原免疫性，同時(shí)相應(yīng)的ELISA法也證實(shí)，4D的ELISA能夠檢測(cè)到的抗4D特異性抗體為25 ng，且在檢測(cè)的靈敏度上可以與免疫熒光法相媲美，但是Tp4D的一個(gè)重大缺陷就是存在著與地方性梅毒菌種的一個(gè)交叉反應(yīng)[12]。同樣在1986年，國(guó)外學(xué)者使用5.6 kb的TpDNA的重組基因的質(zhì)粒做出內(nèi)切酶圖譜后，再成功地轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)。利用免疫雜交點(diǎn)的方法對(duì)TpN37進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于梅毒二期的血清檢測(cè)有效，如果改變檢測(cè)的方法，利用放免和酶免的方法進(jìn)行相應(yīng)的檢驗(yàn)，TpN37與所有血清中的抗體都能夠發(fā)生反應(yīng)，但唯一的不足是對(duì)于陰性對(duì)照則沒有反應(yīng)表現(xiàn)出。在兔梅毒模型中，利用兔子血清制作的特異性兔單克隆抗體能夠有效地被TpN37抗原，并且TpN37抗原不會(huì)與其他的非致病性的螺旋體發(fā)生反應(yīng)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示對(duì)于TpN37而言，其能夠有效的作為血清診斷梅毒的有效抗原[13]。

2 梅毒螺旋體基因重組抗原血清學(xué)診斷的研究進(jìn)展

有相應(yīng)的臨床大樣本量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，Tp凝血實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果與利用Tp基因重組抗原的臨床快速檢測(cè)在檢測(cè)的靈敏度上無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但Tp單一基因重組抗原對(duì)于合并了HIV感染，或者是已經(jīng)接受了一段時(shí)間的抗梅毒治療的患者，或者是處于潛伏期的梅毒患者而言，其檢測(cè)的靈敏度會(huì)大大下降，而如果使用多基因重組的Tp重組基因抗原，則其檢測(cè)的整體靈敏度將會(huì)大大提高，出現(xiàn)的假陰性的比例會(huì)大大減小[14]。

2.1 免疫層析實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)展 利用Tp基因重組的抗原包被膜條測(cè)試區(qū)時(shí)，當(dāng)抗原中的IgG/IgM與膜條測(cè)試區(qū)域中的標(biāo)記的抗人IgG/IgM結(jié)合后，結(jié)合后的復(fù)合物最終層析到膜條測(cè)試區(qū)與特異抗原結(jié)合后所呈現(xiàn)出來(lái)的顯色標(biāo)記就為陽(yáng)性反應(yīng)標(biāo)記[15]。在TPHA的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)下，有學(xué)者將4種不同國(guó)家生產(chǎn)的免疫層析試劑盒用來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果這4個(gè)國(guó)家的免疫層析試劑盒的最終檢測(cè)結(jié)果顯示，不論是在全血還是在血清檢測(cè)的敏感性上，都取得了良好的結(jié)果，上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓人相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，免疫層析實(shí)驗(yàn)將有可能取代傳統(tǒng)的篩查實(shí)驗(yàn)。

2.2 Tp-ELISA的研究進(jìn)展 在目前的Tp-ELISA研究中，聚苯乙烯反應(yīng)板微孔在被Tp重組基因抗原包被，且抗人IgG/IgM在被酶標(biāo)記的情況下，可以有效的對(duì)Tp的IgG/IgM進(jìn)行檢測(cè)。在雙抗原夾心的ELISA法中，酶和反應(yīng)板均對(duì)Tp重組的酶抗原進(jìn)行了標(biāo)記。在利用Tp的3種組合表達(dá)蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)與性病研究實(shí)驗(yàn)、熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)以及TPHA實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度、特異度相比，利用Tp的3種組合表達(dá)蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)處于不同分期的梅毒患者的檢測(cè)的靈敏度、特異度均要顯著高于其他3種方法。而國(guó)外學(xué)者在利用重組的TpN17-15-ELSIA法與WB、以及THBA法相比，在對(duì)正常人和含有疾病的2950份血清的檢測(cè)中，TpN17-15-ELSIA法與WB法均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，而THBA法則出現(xiàn)了交叉反應(yīng)[16]。而在對(duì)Tp多基因嵌合重組抗原與Tp單基因重組抗原的平行檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，Tp多基因嵌合重組抗原檢測(cè)的靈敏性要顯著高于Tp單基因重組抗原，在對(duì)雙抗原夾心ELISA法與間接ELISA法的比較中，雙抗原夾心ELISA法的檢測(cè)準(zhǔn)確性要顯著優(yōu)于間接ELISA法。而目前在投入商業(yè)化使用的Tp重組基因的ELSIA法檢測(cè)試劑盒中，其檢測(cè)的靈敏度和特異度均為100%。

2.3 快速乳膠凝集試驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)的原理上，快速乳膠凝集試驗(yàn)的基本原理與Tp的顆粒凝集試驗(yàn)相似。在臨床實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者利用TpN15、TpN17、TpN47作做為抗原，利用快速乳膠凝集試驗(yàn)法快速檢測(cè)了1518份隨機(jī)得來(lái)的血清樣本，將檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同VDRL法的特異度進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)期檢測(cè)99分梅毒血清樣本，最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，快速乳膠凝集試驗(yàn)與VDRL法檢測(cè)的特異度并無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[17]。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在梅毒的篩查中可以考慮使用快速乳膠凝集試驗(yàn)。

2.4 CLIA法 CLIA法的中文名稱為化學(xué)發(fā)光免疫分析，其基本原理為將固相抗原設(shè)定為Tp基因重組抗原，利用HRP對(duì)第二抗原進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)使用含魯米諾或者是其對(duì)應(yīng)的增強(qiáng)劑作為示蹤劑，通過(guò)最后測(cè)量其發(fā)光數(shù)值的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。我國(guó)學(xué)者通過(guò)使用TpN15、TpN17、TpN47作為對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗原和固相抗原，成功的建立了基于Tp為雙抗原夾心的CLIA法，通過(guò)與TRUST、TPPA、TPHA、Tp-ELISA法平行的檢測(cè)Tp抗體檢測(cè)分別呈陽(yáng)性和陰性的血清，結(jié)果最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這4種方法的陽(yáng)性檢測(cè)率和陰性檢測(cè)率均無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[18]。endprint

2.5 WB法 將Tp的重組基因抗原通過(guò)SDS-PAGE通過(guò)電印轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，再與待檢測(cè)的血清進(jìn)行檢測(cè)后通過(guò)酶標(biāo)記抗人的IgG/IgM。其實(shí)驗(yàn)的基本原理為，如果待檢測(cè)的血清中存在TpN15、TpN17、TpN42、 TpN47、TpN37等抗體，則加酶的底物可以出現(xiàn)反應(yīng)，并且能夠顯色。有國(guó)外學(xué)者將rpN47、rTpNl7、rTpNl5、rTpN42、rTpN37這5種多肽進(jìn)行重組建立recWB法，并與MHA-Tp以及wclWB對(duì)比進(jìn)行梅毒血清的檢測(cè)，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在各項(xiàng)綜合指標(biāo)的評(píng)價(jià)中，recWB法要顯著優(yōu)于wclWB法[19]。

目前部分Tp重組基因的抗原已經(jīng)應(yīng)用于臨床梅毒的檢測(cè)中，其中涉及的Tp基因重組的抗原主要為TpN15、TpN17、TpN47，在初期使用的Tp基因重組抗原多為單一基因的抗原，現(xiàn)在則多為多基因嵌合的抗原，雖然對(duì)于各期梅毒的檢查靈敏度和特異度得到了極大的提高，但是仍然存在著較大的不足，且在實(shí)際中對(duì)于何種Tp抗原的檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確，仍然存在著較大的爭(zhēng)議[20]。目前隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，已經(jīng)逐步能夠解決難以從Tp中純化的微量蛋白數(shù)量問(wèn)題，并已經(jīng)能夠?qū)ζ渚唧w的作用機(jī)制展開相應(yīng)的研究。這也意味著，Tp基因重組抗原應(yīng)用于梅毒的檢測(cè)中的前景更為廣闊。

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（收稿日期：2014-03-17） （本文編輯：王宇）endprint