李振宇+馮云+盧秀波

【摘要】 目的：探討微小RNA（miR）-21在乳腺癌細胞（MCF7）中的作用。方法：對MCF7細胞轉染miR-21，采用免疫組織化學法檢測轉染后程序性細胞凋亡4（PDCD4）表達；用噻唑藍（MTT）比色法測轉染miR-21后MCF7細胞增殖；流式細胞術檢測轉染后MCF7細胞凋亡。結果：經(jīng)免疫組織化學檢測，轉染組未見染色，對照組細胞胞質呈棕褐色，轉染組PDCD4的表達明顯低于對照組，MTT法檢測轉染組細胞活力增加（P<0.05）。轉染組的凋亡率為（3.14±0.24）%，明顯低于空白組、空質粒組的（8.04±0.02）%、（9.41±0.53）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：PDCD4是miR-21的靶基因之一，miR-21的高表達可促進乳腺癌的發(fā)展。

【關鍵詞】 乳腺癌； 微小RNA-21； 程序性細胞死亡因子4

The Role of MicroRNA-21 in Human Breast Cancer Cells/LI Zhen-yu，F(xiàn)ENG Yun，LU Xiu-bo.//Medical Innovation of China，2014，11（28）：004-006

【Abstract】 Objective：To investigate the role of microRNA（miR）-21 in the human breast cancercells（MCF7）.Method：The MCF7 transfection of miR-21 was transited，programmed cell death 4（PDCD4） expression after transfection was detected by immunohistochemical，transfected with miR-21 MCF7 cell proliferation measured by tetrazolium（MTT） assay；transfected MCF7 cells withered die was detected by flow cytometry.Result：The control group was detected by immunohistochemistry，cytoplasmic brown color，the transfection group showed no staining，transfected group programmed cell death 4（PDCD4） expression was significantly lower than the control group，MTT assay transfected cell viability was significantly be promoted（P<0.05）.Transfection group apoptosis rate was（3.14±0.24）%，it was significantly lower than （8.04±0.02）%，（9.41±0.53）% in a blank group and empty plasmid group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：PDCD4 is a miR-21 target genes of high expression of miR-21 can promote the development of human breast cancer.

【Key words】 Breast cancer； miRNA-21； PDCD4

First-authors address：Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang 471009，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.28.002

微小RNA（miRNAs）是一種在真核生物中發(fā)現(xiàn)的內生性RNAs，長度大約為21～25個核苷酸，廣泛存在于哺乳動物基因組中，具有高度的保守性[1]?，F(xiàn)已明確，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的調控作用。筆者通過瞬時轉染miR-21于人乳腺癌細胞系MCF7中，檢測轉染前后細胞的增殖、凋亡及PDCD4的表達，探討兩者的關系及在乳腺癌中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞系MCF7購自南京科諾生物有限公司、Hyclone胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自TM公司（寶信生物科技有限公司分裝）、真核質粒pEZX-eGFP-miR-21（廣州復能基因有限公司）、質粒抽提試劑盒及無內毒素質粒提取試劑盒（北京康為公司）、膠回收試劑盒（TaKaRa公司）、兔PDCD4IgG（Abcam公司）、抗兔抗體（Santa Cruz公司）、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，實驗室配制）、噻唑藍（MTT）試劑盒（Sigma公司）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）細胞凋亡檢測試劑盒（凱基公司）。

1.2 MCF7細胞的培養(yǎng)與細胞瞬時轉染 MCF7細胞于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2孵箱內貼壁培養(yǎng)。細胞轉染利用轉染試劑LipofectamineTM2000，嚴格按說明書進行，熒光顯微鏡于轉染24 h內觀察并估算轉染效率。

1.3 免疫組織化學染色 細胞爬片用4%多聚甲醛固定后，在3%過氧化氫-甲醇溶液條件下，常溫孵育10 min；10%山羊血清室溫孵育10 min；滴加1∶200稀釋的兔PDCD4 IgG單抗后，37 ℃孵育1 h；滴加抗兔生物素化二抗50 μL，37 ℃孵育30 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液于鏡下觀察顏色控制時間3 min。復染、脫水、透明、封片。endprint

1.4 MTT檢測細胞增殖活性 將細胞分為3組，每組6孔，于轉染后l、2、3、4、5、6、7 d測量各組吸光度（A）值，比色時，每孔加MTT溶液（5 g/L）20 μL，37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，結晶充分溶解，以空白調零，選擇570 nm波長，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的A570值，比較各組細胞的增殖抑制率。

1.5 流式細胞儀檢測轉染后細胞凋亡 按照凋亡試劑盒說明書，轉染后48 h按說明書進行操作，檢測轉染后細胞凋亡。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩樣本比較采用配對設計兩兩比較t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MCF7細胞轉染結果 MCF7細胞中較大比例梭型細胞表達綠色熒光蛋白，轉染效率（%）=每高倍鏡視野發(fā)熒光細胞數(shù)/同一視野細胞總數(shù)×100%，24 h轉染效率為（0.834±0.062）%，各組轉染效率的比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 免疫組織化學染色結果 鏡下3組細胞的形態(tài)無明顯差異，以細胞質呈棕褐色為陽性細胞，轉染pEZX組和未轉染組細胞質呈棕褐色；轉染pEZX-eGFP-miR-21組結果為陰性。

2.3 MTT法鑒定細胞增殖活性 結果顯示，轉染組可以明顯促進MCF7細胞的增殖。隨著培養(yǎng)時間的延長，轉染組和空質粒組的細胞數(shù)均有所增加，但轉染組細胞增殖更快，見圖1。

圖1 MCF7細胞轉染miR-21增殖變化

2.4 細胞凋亡 轉染組的凋亡率為（3.14±0.24）%，明顯低于空白組、空質粒組的（8.04±0.02）%、（9.41±0.53）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

miRNA是一類由基因組DNA編碼，具有高度保守性的非編碼小分子RNA片段，它通過與目標mRNA特異性的堿基配對，引起目標mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而對基因表達進行調控，參與生命過程中的一系列重要進程，包括早期胚胎發(fā)育、細胞周期、細胞凋亡、細胞分化調控、傷口愈合、免疫系統(tǒng)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-3]。miRNA與腫瘤密切相關，半數(shù)以上的miRNA編碼基因位于腫瘤相關基因位點和脆性染色體區(qū)域，在不同腫瘤組織中miRNA異常表達且具有組織特異性[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在結腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、惡性膠質瘤等多種實體腫瘤中的表達上調，尤其是在人高度惡性腦膠質母細胞瘤中，miR-21水平可高出癌旁組織5～10倍[7]。但是，miR-21在個別腫瘤中也會出現(xiàn)低表達，如促腎上腺皮質素分泌型垂體瘤的miR-21表達量較正常垂體組織低2.4倍，這可能是由于miR-21在不同組織中發(fā)揮不同的調節(jié)功能所致[8]。程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是Shibahara等[9]1995年在小鼠體內發(fā)現(xiàn)的一個與細胞周期及細胞凋亡相關的基因。通過原位雜交法測得人PDCD4基因定位于10q24，cDNA全長3.5 kb，其中編碼區(qū)約1.4 kb[10]。既往多項研究結果表明，PDCD4是一種腫瘤抑制因子，具有促進細胞凋亡、抑制腫瘤生成的作用[11]。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)當肝癌細胞系Huh7細胞轉染反義PDCD4后，其增殖加速，細胞凋亡受到抑制，提示PDCD4能抑制肝癌細胞系Huh7的增殖，促進其凋亡。Hwang等[13]發(fā)現(xiàn)用PDCD4氣溶膠治療肺癌小鼠后，肺癌細胞的生長周期明顯延長，凋亡顯著加快。Leupold等[14]發(fā)現(xiàn)PDCD4能夠通過抑制尿激酶受體（u-PAR）的表達，抑制腫瘤新生血管的生成，降低腫瘤的侵襲性，改善患者的預后。在大多數(shù)正常組織細胞中，PDCD4蛋白主要位于細胞核，當內環(huán)境改變時也可以通過核輸出信號而表達于細胞質。研究表明，PDCD4在肺癌、前列腺癌和結腸癌中的表達受到抑制[15]。

本實驗結果顯示，MCF7細胞轉染miR-21后分裂增殖能力增強，細胞凋亡受到抑制，提示miR-21與乳腺癌的進展可能有關，應用免疫組織化學技術檢測轉染miR-21的MCF7中PDCD4明顯降低，與對照組差異有統(tǒng)計學意義，證實PDCD4是miR-21的重要靶蛋白，提示在乳腺癌中，miR-21可能是通過作用于其靶蛋白PDCD4來調節(jié)細胞的增殖和凋亡能力，這為進一步研究miR-21在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用奠定了基礎。在乳腺癌中，miRNA-21高表達可能導致抑癌基因PDCD4的失活或低表達，從而促進MCF7細胞的異常增殖，促進乳腺癌的發(fā)展，這將為乳腺癌的進一步的靶向治療提供位點。

參考文獻

[1]沈雷.微小RNA與乳腺癌干細胞的關系[J].同濟大學學報（醫(yī)學版），2011，32（2）：110-114.

[2]趙雋，韓宇.microRNA與腫瘤細胞耐藥的研究進展[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（29）：155-157.

[3]張暢，寧勇.MicroRNA與惡性腫瘤[J].中外醫(yī)學研究，2012，10（1）：159-161.

[4] Giovannetti E，F(xiàn)unel N，Peters G J，et al.MicmRNA-21 in pancreatic cancer：correlation with clinical outcome and pharmacologic aspects underlying its role in the modulation of gemeitabine activity[J].Cancer Res，2010，70（11）：4528-4538.

[5] Zhu L，Yan W，Rodriguez-Canales J，et al.MicroRNA analysis of mierodissected normal squamous esophageal epithelium and tumor ceils[J].Am J Cancer Res，2011，1（5）：574-584.endprint

[6] Wei J，Gao W，Zhu C J，et al.Identification of plasma microRNA-2l as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer[J].Chin J Cancer，2011，30（6）：407-414.

[7]劉洋，盧秀波，耿祖仕，等.微小RNA-21真核表達載體構建及其對甲狀腺乳頭狀癌細胞程序性細胞凋亡4蛋白的影響[J].中華實驗外科雜志，2013，30（3）：487-489.

[8]李林，陳曉銳.PDCD4基因在過氧化氫誘導喉癌細胞凋亡中的作用[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2010，19（1）：72-76.

[9] Shibahara K，Asano M，Ishida Y，et al.Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death[J].Gene，1995，166（2）：297-301.

[10] Soejima H，Miyoshi O，Yoshinaga H，et al.Assignment of the programmed cell death 4 gene（PDCD4） to human chromosome band 10q24 by in situ hybfidization[J].Cytogenet Cell Genet，1999，87（1-2）：113-114.

[11]萬冬，楊廷桐，秦玉鳳，等.miRNA21/PDCD4環(huán)路在卵巢癌組織中的表達[J].腫瘤防治研究，2013，40（9）：869-872.

[12] Zhang H，Ozaki I，Mizuta T，et al.Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-beta1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2006，25（45）：6101-6112.

[13] Hwang S K，Jin H，Kwon J T，et al.Aerosol-delivered programmed cell death 4 enhanced apoptosis，controlled cell cycle and suppressed AP-1 activity in the lungs of AP-1 luciferase reporter mice[J].Gene Ther，2007，14（18）：1353-1361.

[14] Leupold J H，Yang H S，Colburn N H，et al.Tumor suppressor Pdcd4 inhibits invasion/intravasation and regulates urokinase receptor （u-PAR） gene expression via Sp-transcription factors[J].Oncogene，2007，26（31）：4550-4562.

[15]許傳兵，徐忠華，劉照旭，等.抑癌基因Pdcd4在腎透明細胞癌中的表達及生物學意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2010，22（18）：2775-2778.

（收稿日期：2014-03-05） （本文編輯：歐麗）endprint

[6] Wei J，Gao W，Zhu C J，et al.Identification of plasma microRNA-2l as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer[J].Chin J Cancer，2011，30（6）：407-414.

[7]劉洋，盧秀波，耿祖仕，等.微小RNA-21真核表達載體構建及其對甲狀腺乳頭狀癌細胞程序性細胞凋亡4蛋白的影響[J].中華實驗外科雜志，2013，30（3）：487-489.

[8]李林，陳曉銳.PDCD4基因在過氧化氫誘導喉癌細胞凋亡中的作用[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2010，19（1）：72-76.

[9] Shibahara K，Asano M，Ishida Y，et al.Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death[J].Gene，1995，166（2）：297-301.

[10] Soejima H，Miyoshi O，Yoshinaga H，et al.Assignment of the programmed cell death 4 gene（PDCD4） to human chromosome band 10q24 by in situ hybfidization[J].Cytogenet Cell Genet，1999，87（1-2）：113-114.

[11]萬冬，楊廷桐，秦玉鳳，等.miRNA21/PDCD4環(huán)路在卵巢癌組織中的表達[J].腫瘤防治研究，2013，40（9）：869-872.

[12] Zhang H，Ozaki I，Mizuta T，et al.Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-beta1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2006，25（45）：6101-6112.

[13] Hwang S K，Jin H，Kwon J T，et al.Aerosol-delivered programmed cell death 4 enhanced apoptosis，controlled cell cycle and suppressed AP-1 activity in the lungs of AP-1 luciferase reporter mice[J].Gene Ther，2007，14（18）：1353-1361.

[14] Leupold J H，Yang H S，Colburn N H，et al.Tumor suppressor Pdcd4 inhibits invasion/intravasation and regulates urokinase receptor （u-PAR） gene expression via Sp-transcription factors[J].Oncogene，2007，26（31）：4550-4562.

[15]許傳兵，徐忠華，劉照旭，等.抑癌基因Pdcd4在腎透明細胞癌中的表達及生物學意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2010，22（18）：2775-2778.

（收稿日期：2014-03-05） （本文編輯：歐麗）endprint

[6] Wei J，Gao W，Zhu C J，et al.Identification of plasma microRNA-2l as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer[J].Chin J Cancer，2011，30（6）：407-414.

[7]劉洋，盧秀波，耿祖仕，等.微小RNA-21真核表達載體構建及其對甲狀腺乳頭狀癌細胞程序性細胞凋亡4蛋白的影響[J].中華實驗外科雜志，2013，30（3）：487-489.

[8]李林，陳曉銳.PDCD4基因在過氧化氫誘導喉癌細胞凋亡中的作用[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2010，19（1）：72-76.

[9] Shibahara K，Asano M，Ishida Y，et al.Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death[J].Gene，1995，166（2）：297-301.

[10] Soejima H，Miyoshi O，Yoshinaga H，et al.Assignment of the programmed cell death 4 gene（PDCD4） to human chromosome band 10q24 by in situ hybfidization[J].Cytogenet Cell Genet，1999，87（1-2）：113-114.

[11]萬冬，楊廷桐，秦玉鳳，等.miRNA21/PDCD4環(huán)路在卵巢癌組織中的表達[J].腫瘤防治研究，2013，40（9）：869-872.

[12] Zhang H，Ozaki I，Mizuta T，et al.Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-beta1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2006，25（45）：6101-6112.

[13] Hwang S K，Jin H，Kwon J T，et al.Aerosol-delivered programmed cell death 4 enhanced apoptosis，controlled cell cycle and suppressed AP-1 activity in the lungs of AP-1 luciferase reporter mice[J].Gene Ther，2007，14（18）：1353-1361.

[14] Leupold J H，Yang H S，Colburn N H，et al.Tumor suppressor Pdcd4 inhibits invasion/intravasation and regulates urokinase receptor （u-PAR） gene expression via Sp-transcription factors[J].Oncogene，2007，26（31）：4550-4562.

[15]許傳兵，徐忠華，劉照旭，等.抑癌基因Pdcd4在腎透明細胞癌中的表達及生物學意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2010，22（18）：2775-2778.

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