歐陽(yáng)文 ，朱曉艾 ，劉潤(rùn)南 ，劉曉娟 ，粟龍杰 ，謝 磊 ，曹 庸 *（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 4008；.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 5064）

番石榴葉具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的倍半萜雜二醛分離與鑒定

歐陽(yáng)文1，朱曉艾2，劉潤(rùn)南1，劉曉娟2，粟龍杰1，謝 磊1，曹 庸2*（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

目的分離純化番石榴葉乙酸乙酯萃取物，并對(duì)其抑制α-葡萄糖苷酶活性作用進(jìn)行研究。方法采用硅膠、凝膠柱層析分離純化，波譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，比色法進(jìn)行活性測(cè)定。結(jié)果分離得到三種倍半雜萜二醛，分別鑒定為psidials A，psiguadial A和guajadial；活性測(cè)試結(jié)果顯示guajadial具有抑制α-葡萄糖苷酶活性，且顯著優(yōu)于阿卡波糖。結(jié)論首次報(bào)導(dǎo)guajadial為番石榴葉具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的成分。

番石榴葉；倍半萜雜二醛；分離鑒定；α-葡萄糖苷酶

隨著世界人口的老齡化以及飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的改變，糖尿病己經(jīng)成為一種常見病、多發(fā)病，由糖尿病并發(fā)癥引起的死亡人數(shù)己列于心腦血管疾病和癌癥之后，成為第三大死亡原因，因此尋找安全、有效的途徑預(yù)防和治療糖尿病的發(fā)生發(fā)展已成為緊迫的國(guó)際性任務(wù)[1-2]。番石榴（Psidium guajava Linn.）為桃金娘科番石榴屬果樹，民間的廣泛應(yīng)用和大量的科學(xué)研究結(jié)果證明番石榴葉具有明顯的降糖作用且無(wú)毒副作用[3-6]，在日本，F(xiàn)OSHU（特定保健用食品）已有批準(zhǔn)作為防治II型糖尿病的含番石榴葉提取物的番石榴茶上市[7]。Oh等[8]報(bào)道了番石榴葉乙酸乙酯萃取物能夠抑制α-葡萄糖苷酶，同時(shí)可改善高凝血癥；Wang等[9]通過建立抑制α-葡萄糖苷酶模型，證明了番石榴葉乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物為具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的最佳組分。本實(shí)驗(yàn)前期的結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，本文繼續(xù)對(duì)番石榴葉乙酸乙酯萃取物進(jìn)行了分離純化研究，獲得了三個(gè)倍半萜雜二醛化合物，同時(shí)通過96孔比色法，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照組，對(duì)三個(gè)倍半萜雜二醛單體抑制α-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

番石榴葉，于2012年9月采自廣東省茂名市林業(yè)局番石榴種植基地，經(jīng)湖南吉首大學(xué)廖博儒教授鑒定為桃金娘科番石榴屬植物Psidium guajavaLinn.，植物標(biāo)本（2012-09-A01）現(xiàn)存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院天然活性物研究中心。

1.2 儀器與試劑

INOVA-500MHz高分辨超導(dǎo)核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司)，萬(wàn)分之一電子天平 (梅特勒-托利多)，Wallac VICTOR31420酶標(biāo)儀 （美國(guó)PE公司）。α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）（日本 TCI公司）；阿卡姆糖（Sigma 公司）；薄層層析用硅膠G、H，柱層析用硅膠(100～200目)(青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20(美國(guó)GE公司)，其他試劑均為分析純。水為超純水。

2 方法

2.1 提取與分離純化

番石榴葉2 kg，粉碎成粗粉，用12倍體積95%乙醇回流冷浸提取3次，60℃減壓回收溶劑，加適量水分散，乙酸乙酯液充分萃取，減壓回收溶劑得乙酸乙酯浸膏45.9 g。取乙酸乙酯萃取浸膏40 g，經(jīng)硅膠常壓、低壓柱層析，重結(jié)晶及葡萄糖凝膠LH-20(SephadexLH-20)層析，共分離得到了化合物1（132 mg）、化合物 2（22 mg）、化合物 3（42 mg）。

2.2 抑制α葡萄糖苷酶活性測(cè)定

[10-11]，略有改動(dòng)，在96孔板中進(jìn)行比色法測(cè)定：首先將20 μL的α-葡萄糖苷酶 (0.8 U/mL)加入到樣品孔中，平行6份，然后將測(cè)試樣品溶于DMSO配制成母液，用0.01 mol/L pH 6.8磷酸緩沖液按一定比例稀釋，每孔加入樣品溶液120 μL（測(cè)試樣品的最終濃度見表1），37℃條件下預(yù)培養(yǎng)15 min，再加入5 mmol/L反應(yīng)底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液20 μL。37℃水浴反應(yīng)15 min后，每個(gè)樣品孔中加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液80 μL終止反應(yīng)，在405 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定吸光度。

實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性空白、陰性對(duì)照、樣品空白、樣品組；其中陰性對(duì)照為溶解樣品溶液按測(cè)試樣品的最終濃度同樣用磷酸緩沖液稀釋加入反應(yīng)，陰性空白為緩沖溶液代替酶溶液；樣品空白為相同體積的磷酸緩沖液代替酶溶液?；衔镆种坡视蓸悠稯D值對(duì)于空白和對(duì)照OD值計(jì)算，計(jì)算公式如下：

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)所獲得的單體化合物，采用薄層層析分析純度，純度合格后測(cè)定單體化合物的核磁共振譜，同時(shí)對(duì)獲得的波譜數(shù)據(jù)綜合解析，并與文獻(xiàn)比較進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 抑制α-糖苷酶活性測(cè)定

通過建立抑制α-葡萄糖苷酶活性測(cè)試模型，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定了乙酸乙酯萃取物的抑制活性，結(jié)果表明阿卡波糖在625～156 μg/mL范圍內(nèi)劑量依賴性地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其IC50為（358.2±9.2）μg/mL，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11]接近；乙酸乙酯萃取物在312.5～1 250 μg/mL范圍內(nèi)呈劑量依賴性地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其IC50為（1 129.9±53.7）μg/mL。

繼續(xù)對(duì)乙酸乙酯萃取組分進(jìn)行分離純化，獲得了三個(gè)單體化合物，測(cè)定其抑制α-葡萄糖苷酶活性，結(jié)果顯示化合物1（psidials A）和化合物2（psiguadial A）在 625～10 μg/mL 濃度范圍內(nèi)無(wú)明顯抑制效果， 而化合物 3 （guajadial）在 78.1～19.3 μg/mL濃度內(nèi)呈劑量依賴性地抑制α-糖苷酶活性，其 IC50為（52.3±2.6）μg/mL，顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖。見表1。

表1番石榴葉乙酸乙酯萃取物和guajadial抑制 α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定 （±s，n=6）

表1番石榴葉乙酸乙酯萃取物和guajadial抑制 α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定 （±s，n=6）

注：與乙酸乙酯萃取物比較#P<0.05；與阿卡波糖比較*P<0.05。

阿卡波糖625 57.9–5.62 312.5 44.6–3.98 156.2 28.8–3.74乙酸乙酷萃取物1250 51.2–2.69 625 29.3–3.421129.9–53.7 312.5 8.02–1.78化合物3(guajadial) 19.3 17.0–3.93 78.1 73.3–3.89 39.1 42.4–4.08

3.2 單體結(jié)構(gòu)鑒定

3.2.1 化合物1 無(wú)色方狀結(jié)晶，香草醛-濃硫酸顯紫紅色，1H-NMR （CDCl3，500 MHz）：δ13.46，13.11，10.12，10.17(1H，each s)，7.1-7.3(5H，m)，5.05(1H，d，J=12.0 Hz)，4.20 (1H，d，J=6.0 Hz)，0.98，1.01，1.19(3H，each s)；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：δ59.3(C-1)，23.9(C-2)，47.8(C-3)，88.0(C-4)，35.0(C-5)，24.4(C-6)，35.5(C-7)，150.8(C-8)，42.2(C-9)，36.1(C-10)，34.7(C-11)，29.7(C-12)，21.7(C-13)，22.2(C-14)，111.2(C-15)，35.0(C-1’)，107.5(C-2’)，168.5(C-3’)，104.2(C-4’)，167.5(C-5’)，104.7(C-6’)，164.1(C-7’)，138.6(C-8’)，129.9(C-9’)，128.0(C-10’)，126.9(C-11’)，128.0(C-12’)，129.9(C-13’)，192.0(C-14’)，191.6(C-15’)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[12]報(bào)道的psidials A一致。

3.2.2 化合物2 無(wú)色針狀結(jié)晶，香草醛-濃硫酸顯紫紅色，1H-NMR （CDCl3，500 MHz）：δ13.78，13.56，10.40，10.14(1H，each s)，7.1-7.3(5H，m)，4.5(1H，s)，1.14(3H，s)，1.12(3H，d，J=6.5 Hz)，0.93(3H，s)，0.59(1H，m)，0.31 (1H，dd，J=8.5，12.0 Hz)，0.25(3H，s)；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：δ104.1(C-1)，36.6(C-2)，37.9(C-3)，47.8(C-4)，48.7(C-5)，26.3(C-6)，23.9(C-7)，20.3(C-8)，30.3(C-9)，39.9(C-10)，19.2(C-11)，28.4(C-12)，14.3(C-13)，17.4(C-14)，24.9(C-15)，53.2(C-1’)，114.2(C-2’)，166.7(C-3’)，108.2(C-4’)，168.2(C-5’)，105.6(C-6’)，170.5(C-7’)，140.9(C-8’)，130.3(C-9’)，127.6(C-10’)，126.4(C-11’)，127.6(C-12’)，130.3(C-13’)，193.7(C-14’)，191.8(C-15’)。 以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[13]報(bào)道的psiguadial A一致。

3.2.3 化合物3 無(wú)色針狀結(jié)晶，香草醛-濃硫酸顯紫紅色，1H-NMR （CDCl3，500 MHz）：δ13.46，13.08，10.12，10.08(1H，each s)，7.1-7.3(5H，m)，4.56(1H，s)，4.06(1H，s)，3.40(1H，d，J=10.0 Hz)，1.28(3H，s)，1.03(3H，s)，1.00(3H，s)；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：δ53.2(C-1)，22.2(C-2)，37.1(C-3)，84.3(C-4)，43.4(C-5)，30.4(C-6)，35.4(C-7)，150.7(C-8)，41.3(C-9)，36.7(C-10)，33.8(C-11)，30.3(C-12)，22.0(C-13)，21.2(C-14)，110.2(C-15)，43.4(C-1’)，105.5(C-2’)，163.4(C-3’)，104.1(C-4’)，168.3(C-5’)，104.7(C-6’)，169.5(C-7’)，143.7(C-8’)，128.7(C-9’)，127.9(C-10’)，126.2(C-11’)，127.9(C-12’)，128.7(C-13’)，192.1(C-14’)，191.5(C-15’)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[14]報(bào)道的 guajadial一致。

以上三種化合物結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 番石榴葉乙酸乙酯萃取物三種倍半雜萜二醛結(jié)構(gòu)式

4 討論

從具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的乙酸乙酯萃取物中分得的三種倍半雜二醛，經(jīng)CA文獻(xiàn)檢索，該類罕見新穎骨架唯獨(dú)存在于番石榴葉中。

通過單體化合物的抑制α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定，表明化合物3（guajadial）的抑制活性顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物阿卡波糖，推測(cè)其為番石榴葉降糖活性成分之一。

化合物 1（psidials A）和化合物 3（guajadial）為同分異構(gòu)體，兩者的差異僅僅在1’位苯基取代的空間構(gòu)效上的差異，其中化合物1的C-1’苯基為α構(gòu)構(gòu)型，無(wú)抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，而化合物3的C-1’苯基為β構(gòu)型，有顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，結(jié)合文獻(xiàn)[15]表明苯基的存在與否對(duì)于降糖活性起關(guān)鍵性作用，同時(shí)其空間構(gòu)型也是影響活性的重要因素。

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（本文編輯 楊 瑛）

Sesquiterpenoids with α-Glucosidase Inhibitory Activities from the Leaves of Psidium guajava Linn.

OU Yangwen1,ZHU Xiaoai2,LIU Runnan1,LIU Xiaojuan2,SU Longjie1,XIE Lei1,CAO Yong2*
(1.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208;2.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong 510642,China)

ObjectiveTo study the α-glucosidase inhibitory active compounds from the ethyl acetate extract of guava leaves.MethodsThe compounds were separated from the ethyl acetate extract by repeating silica gel and Sephadex LH-20 column chromatography.The1H-NMR,13C-NMR techniques were used to identify the chemicalstructures.The α-glucosidaseinhibitory activities were tested by colorimetry.ResultsThree special meroterpenoids were isolated and identified as psidials A,psiguadial A and guajadial.Guajadial showed α-glucosidase inhibitory activities significantly and its activity was better than that of Acarbose.Conclusions Guajadial as one of the α-glucosidase inhibitory active compound from Guava leaves was reported for the first time.

leavesofPsidium guajava Linn.;Meroterpenoids;isolation and structural identification;α-Glucosidase

* 曹 庸，男，教授，E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.08.005.017.04

2014－05－17

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（31201321）；湖南省教育廳項(xiàng)目（13B084）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013J4100075）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)本科教學(xué)質(zhì)量工程項(xiàng)目（TD-007）。

歐陽(yáng)文，男，博士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。