楊光明，彭小勇，李 濤，徐 競(jìng)，劉良明 (第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第二研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042)

環(huán)孢素A(cyclosporin A，CsA)是一種由11個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽，作為一種免疫抑制劑，已廣泛應(yīng)用于抑制器官移植術(shù)后的排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療。CsA能夠抑制線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開(kāi)放，在缺血缺氧再灌注引起的心、腦等器官損傷中發(fā)揮保護(hù)作用［1-2］。線(xiàn)粒體MPTP是位于線(xiàn)粒體內(nèi)外膜間的多蛋白孔道，在線(xiàn)粒體功能調(diào)節(jié)和細(xì)胞缺血缺氧性損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［3-4］。但是，在休克狀態(tài)下，通過(guò)抑制線(xiàn)粒體MPTP能否改善病理?xiàng)l件下的心血管功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)休克動(dòng)物的保護(hù)作用，目前尚不清楚。我們采用大鼠創(chuàng)傷失血性休克模型，觀察不同劑量CsA對(duì)休克大鼠存活時(shí)間、24 h存活率、平均動(dòng)脈血壓及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響，以明確CsA是否對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠具有保護(hù)作用及其適宜的治療劑量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠144只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法

1.2.1 CsA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠24 h存活率和存活時(shí)間的影響 實(shí)驗(yàn)分6組，分別為正常對(duì)照組、休克對(duì)照組、乳酸林格氏液(LR)復(fù)蘇組、CsA 1 mg/kg組、CsA 5 mg/kg組、CsA 10 mg/kg組。每組16只動(dòng)物。創(chuàng)傷失血性休克模型的建立方法［5］:用3%戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，右側(cè)股動(dòng)脈和股靜脈插管，分別用于觀察血壓、放血和給藥復(fù)蘇，經(jīng)插管注射肝素鈉生理鹽水(500 U/kg)抗凝。用老虎鉗折斷左側(cè)股骨，通過(guò)股動(dòng)脈插管10 min內(nèi)放血至血壓40 mmHg，維持3 h。各實(shí)驗(yàn)組的給藥復(fù)蘇方法:LR復(fù)蘇組給予2倍失血量的LR輸注，CsA 1、5、10 mg/kg組分別在2倍失血量的LR中加入CsA 1、5、10 mg/kg后輸注。復(fù)蘇均使用輸液泵，輸注速度為20 mL/h，約30 min輸注完畢。休克對(duì)照組在休克模型建立后不予復(fù)蘇治療。復(fù)蘇完畢后拔除各血管插管，結(jié)扎血管，縫合傷口，肌肉注射青霉素和鏈霉素(105U/kg)，給予正常飲食，觀察動(dòng)物存活情況至24 h，記錄存活時(shí)間并計(jì)算存活率。

1.2.2 CsA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響 實(shí)驗(yàn)分組同上，每組8只動(dòng)物，模型的復(fù)制及復(fù)蘇方法同上。經(jīng)右頸動(dòng)脈插管至左心室，連接血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定儀(Power Lab，澳大利亞AD Instrument公司)，分別在休克前、休克末、復(fù)蘇1 h、2 h測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)［6］，包括左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室壓力最大上升/下降速率(±dp/dtmax)和心率(HR)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠存活情況的影響

正常對(duì)照組中全部大鼠存活均超過(guò)24 h;休克對(duì)照組大鼠在休克后8 h內(nèi)全部死亡，平均存活時(shí)間約為3 h;LR復(fù)蘇組24 h存活率為25%，平均存活時(shí)間為11.4 h;CsA 1 mg/kg輸注后，大鼠存活時(shí)間和24 h存活率分別為12.8 h和31.2%，略高于LR組;CsA 5 mg/kg和10 mg/kg輸注可明顯改善休克動(dòng)物的存活情況，存活時(shí)間分別為 17.9、17.3 h，24 h存活率均為56.3%(圖1)。

圖1 CsA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠存活時(shí)間的影響

2.2 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠MAP和HR的影響

休克后大鼠MAP顯著降低，復(fù)蘇后MAP均有不同程度升高。不同劑量的CsA輸注后都能升高創(chuàng)傷失血性休克大鼠MAP，高于LR復(fù)蘇組。在復(fù)蘇2 h時(shí)，休克對(duì)照組、LR復(fù)蘇組、CsA 1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg 組大鼠 MAP 分別為(40.8±12.3)(51.1 ±9.7)(62.3 ±12.0)(67.1 ±6.3)(66.3 ± 5.8)mmHg，分別為正常對(duì)照組的 37.3%、46.7%、56.9%、61.3%、60.5%，其中CsA 5 mg/kg和10 mg/kg組與LR組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。CsA輸注也恢復(fù)了休克后降低的HR，但CsA各劑量組與LR組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠LVSP和LVEDP的影響

休克后各組LVSP均明顯降低，輸注LR后LVSP回升至(73.6 ±14.3)mmHg，但顯著低于正常對(duì)照組(127.1 ±14.2)mmHg(P＜0.01)。CsA 5 mg/kg和10 mg/kg輸注可明顯升高LVSP，在輸液后2 h時(shí)LVSP分別為(121.2±14.4)mmHg和(119.9±15.2)mmHg，明顯高于LR組(P＜0.05)，并接近正常水平;CsA 1 mg/kg輸注也升高了休克大鼠LVSP，但與LR組比較無(wú)顯著差異。各組間LVEDP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠±dp/dtmax的影響

休克后各組的±dp/dtmax均明顯下降，各劑量CsA輸注可使降低的±dp/dtmax明顯回升，其中CsA 5 mg/kg組和10 mg/kg組的效果較為顯著。在輸液后2 h時(shí)，LR復(fù)蘇組的±dp/dtmax分別為(5 118.0±892.0)mmHg/s和 (－4 689.1±531.1)mmHg/s，而 CsA 5 mg/kg 組 分 別 為 (6 424.2 ±674.1)mmHg/s、(－5 783.6 ± 721.7)mmHg/s，CsA 10 mg/kg組的 ±dp/dtmax分別為(6 343.0 ±618.9)mmHg/s、(－5 737.5±522.2)mmHg/s，明顯高于 LR 復(fù)蘇組(P ＜0.05)，并接近正常水平;CsA 1 mg/kg輸注的效果與LR組比較無(wú)顯著性差異。

3 討論

線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換是損害性刺激(如氧化應(yīng)激、鈣超載、缺氧和細(xì)胞毒性藥物等)引起線(xiàn)粒體膜通透性發(fā)生突然升高的一種現(xiàn)象，它在線(xiàn)粒體損傷及隨后的細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞凋亡或壞死中扮演重要角色［7］。目前認(rèn)為線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換是由線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開(kāi)放所引起。MPTP是橫跨線(xiàn)粒體內(nèi)、外膜之間的非選擇性通道，但其具體組成尚不完全清楚，通常認(rèn)為它是由位于線(xiàn)粒體內(nèi)、外膜上多種蛋白組成的復(fù)合孔道，主要由外膜的電壓依賴(lài)性陰離子通道(VDAC)、內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(ANT)和基質(zhì)的親環(huán)蛋白D(CyP-D)組成［8-9］。近來(lái)研究表明，MPTP開(kāi)放在組織細(xì)胞的缺血性、氧化性損害中起著重要作用。采用MPTP的抑制劑環(huán)孢素A(CsA)處理，可明顯減輕缺血-再灌注和缺氧-復(fù)氧所引起的心肌和腦組織損傷［1，2，10］。采用 CsA 抑制線(xiàn)粒體 MPTP 開(kāi)放能否改善休克動(dòng)物的心血管功能、發(fā)揮抗休克作用目前尚不清楚。本研究采用大鼠創(chuàng)傷失血性休克模型研究CsA對(duì)休克動(dòng)物存活時(shí)間、24 h存活率、平均動(dòng)脈血壓及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsA可明顯延長(zhǎng)休克大鼠的存活時(shí)間，提高24 h存活率，改善休克后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)MAP、LVSP、±dp/dtmax，表明CsA對(duì)創(chuàng)傷失血性休克有較好的治療作用。

環(huán)孢素A(CsA)作為一種強(qiáng)效免疫抑制劑，已廣泛用于器官移植術(shù)后的排斥反應(yīng)，隨著研究的深入，CsA在自身免疫性疾病、血液病、皮膚病和呼吸系統(tǒng)疾病等方面的治療作用也逐步被發(fā)現(xiàn)。但是，在臨床應(yīng)用中，CsA在用藥劑量過(guò)大或用藥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，包括肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性和胃腸道反應(yīng)等［11］。因此，選擇適宜的劑量和給藥方式對(duì)發(fā)揮CsA的治療作用、減少不良反應(yīng)十分重要。本實(shí)驗(yàn)采用靜脈一次性給藥的方式，觀察3種劑量的CsA(1、5、10 mg/kg)的抗休克作用，發(fā)現(xiàn) 5 mg/kg和10 mg/kg的CsA均有明顯的改善血流動(dòng)力學(xué)、提高休克動(dòng)物存活率的作用，而CsA 1 mg/kg的治療作用與LR組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果提示，5 mg/kg和10 mg/kg的CsA都顯示了較好的抗休克作用，且兩者的治療效果無(wú)明顯差異，那么在臨床應(yīng)用中 CsA 5 mg/kg可能是較好的選擇，采用這一劑量能在發(fā)揮CsA治療作用的同時(shí)減少其不良反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明環(huán)孢素A具有較好的抗創(chuàng)傷失血性休克作用，其中以5 mg/kg和10 mg/kg的效果較為明顯。這一研究發(fā)現(xiàn)為以線(xiàn)粒體MPTP為調(diào)節(jié)靶點(diǎn)、將MPTP抑制劑CsA應(yīng)用于創(chuàng)傷休克的治療提供了理論基礎(chǔ)，但CsA對(duì)重要生命器官功能的影響如何，需要進(jìn)一步研究證明。

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