侯進(jìn)義，沈 霞，孫菊光 (徐州市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇徐州 221000)

腦缺血后組織損傷涉及多方面的機(jī)制，如細(xì)胞凋亡、缺血區(qū)局部腦血流的減少、毛細(xì)血管通透性增加、自由基的形成、p淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性、鈣離子超載及神經(jīng)興奮毒效應(yīng)等多種因素，所有這些反應(yīng)的中心都是微血管，所以對于血腦屏障在腦缺血中作用的研究就顯得越來越重要。緊密連接(TJ)是保持BBB完整性的重要因素［1］。1993 年，F(xiàn)uruse等［2］分離出第一個TJ跨膜蛋白，稱為Occludin。大量研究表明，缺血性中風(fēng)存在BBB的損傷，并影響Occludin等BBB相關(guān)蛋白的表達(dá)［3-4］。隨著對雌激素治療缺血性腦血管病基礎(chǔ)研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)雌激素對缺血后神經(jīng)元及內(nèi)皮細(xì)胞均有保護(hù)作用。能夠在缺血級聯(lián)反應(yīng)中對抗各種炎癥因子的損害，減輕大鼠腦缺血再灌注引起的皮層損傷，拮抗大鼠腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善缺血區(qū)神經(jīng)元的能量代謝和蛋白合成，在多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)發(fā)揮作用［5-6］。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，探討雌激素對大鼠腦缺血再灌注后BBB的通透性、occludin的影響，進(jìn)一步探討雌激素在腦缺血中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雌性清潔級 SD大鼠，鼠齡3個月，體質(zhì)量240～300 g，由徐州醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供;動物自由飲食，室溫22℃，晝夜節(jié)律下飼養(yǎng);一抗(occludin兔源性多克隆抗體)購自Santa Cruz公司，二抗(抗兔IgG/AP)購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 去卵巢手術(shù) 測定大鼠體質(zhì)量并記錄，手術(shù)切除大鼠雙側(cè)卵巢后單籠放置。術(shù)后禁水2 h，禁食4 h。手術(shù)后10 d大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 大腦中動脈閉塞(MCAO)局灶性腦缺血－再灌注模型動物室溫飼養(yǎng)，室內(nèi)采光、通風(fēng)。實(shí)驗(yàn)前24 h禁食、2 h禁水。采用 Longa線栓改良法［7］建立大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血(MCAO)模型。

1.2.3 分組及給藥 健康雌性去勢SD大鼠139只隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組、模型組、雌激素預(yù)處理組，每組又分為再灌4 h、24 h、3 d亞組。BBB通透性和腦組織含水量的檢測:每亞組取6只大鼠;電鏡觀察:取模型組、雌激素預(yù)處理組24 h、3 d亞組，每亞組取2只大鼠;免疫印跡檢測:每亞組取3只大鼠。雌激素預(yù)處理組于術(shù)前30 min肌肉注射苯甲酸雌二醇(1 mg/kg)，假手術(shù)組、模型組于術(shù)前肌肉注射生理鹽水。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法及檢測指標(biāo) 神經(jīng)功能缺損依據(jù)Longa的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。取EB混合甲酰胺，共做7管，其濃度分別為 8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 ug/mL，60 ℃ 避光水浴24 h，于紫外分光光度儀上(波長632 nm)進(jìn)行比色，蒸餾水作空白對照，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線［8］。腦缺血再灌注后各時間點(diǎn)前1 h將動物麻醉，經(jīng)左側(cè)股靜脈注射2%EB生理鹽水(2 mL/kg)，可見注入后大鼠四肢末端很快變藍(lán)，1 h后斷頭取腦。取腦前行生理鹽水心臟灌注，直至右心耳流出清亮液體，以減少血管殘留部分EB的影響。然后迅速取右半球缺血區(qū)腦組織和左側(cè)對應(yīng)區(qū)域腦組織，稱取濕重后置于等量體積甲酰胺(1 mL/100 mg)的試管中，放入60℃恒溫水浴箱，加蓋遮光水浴24 h，然后1 000 r/min離心5 min，取上清液，置可見分光光度計(jì)(波長632 nm)測光密度(optical density，OD)值，以蒸餾水作空白比色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得EB含量(μg/mL濕重)。

1.2.5 腦組織含水量 大鼠處死后，取大鼠右側(cè)缺血區(qū)及對側(cè)大腦稱濕重，置90℃恒溫干燥箱內(nèi)，干燥72 h，稱其干重，按Elltot公式計(jì)算腦含水量:腦組織含水量(%)=100×(濕重一干重)/濕重。

1.2.6 BBB的超微結(jié)構(gòu) 大鼠處死后，取右側(cè)大腦額頂葉腦皮質(zhì)組織，大小為1 mm×1 mm×1 mm，立即放入2.5%戊二醛中固定24 h，1%的四氧化鋨后固定，乙醇逐級脫水，Epon618環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾－檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察并攝像。

1.2.7 Occludin 蛋白的 Western blot分析 將樣品置于0.5 mL勻漿液中，于機(jī)械粉碎機(jī)下將組織粉碎，操作過程在冰上進(jìn)行。離心，1 000轉(zhuǎn)，4℃，15 min，取上清液放于新的Eppendorf管中。取 20 ul蛋白樣品加人380 ul Folin甲溶液中30℃水浴15 min，加入Folin乙溶液中混勻30℃水浴30 min，標(biāo)準(zhǔn)BSA試劑做空白對照。在波長650 nm處進(jìn)行比色測OD值，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線進(jìn)行定量。Western blot分析;將蛋白樣品用勻漿液調(diào)成相同濃度，加入相同體積上樣緩沖液，沸水煮5 min進(jìn)行蛋白變性。取100 ug總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠100 v分離膠200 v，65 min。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，電流40 mA，共計(jì)1 h。將膜用脫脂奶粉封閉1 h，加入兔源性多克隆occludin抗體(1∶400稀釋)，4℃，過夜。washing buffer洗5 min，3次。加人堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗IgG 抗體(1∶1 000稀釋)，室溫，2 h，washing buffer洗 5 min，3次，加人NBT/BCIP顯色液顯色，約15 min，用蒸餾水終止反應(yīng)。結(jié)果通過天能圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 雌激素對腦缺血大鼠BBB通透性的影響

與假手術(shù)組比較，局灶性腦缺血4 h，模型組大鼠腦組織EB含量增加(P＜0.05)，隨缺血時間延長，腦組織EB含量持續(xù)增加，至24 h達(dá)到高峰(P＜0.01)。與同時間點(diǎn)模型組比較，各治療組大鼠EB含量均有不同程度降低(P＜0.05或P ＜0.01)，以24 h組降低最為顯著(P ＜0.01)，見表1。

表1 各時間點(diǎn)腦組織EB含量測定結(jié)果(，μg/mL)

表1 各時間點(diǎn)腦組織EB含量測定結(jié)果(，μg/mL)

*:與模型組比較，P ＜0.05;#:與模型組比較，P ＜0.01

2.2 雌激素對腦缺血大鼠腦組織含水量的影響

與假手術(shù)組比較，局灶性腦缺血4 h模型組大鼠腦組織含水量增加(P＜0.05)，隨缺血時間延長，腦組織含水量持續(xù)增加，至24 h達(dá)到高峰(P＜0.01)。與同時間點(diǎn)模型組比較，各治療組大鼠腦含水量均有不同程度降低(P＜0.05或P ＜0.01)，以24 h組降低最為顯著(P ＜0.01)，見表2。

表2 各時間點(diǎn)腦組織含水量測定結(jié)果(，%)

表2 各時間點(diǎn)腦組織含水量測定結(jié)果(，%)

*:與模型組比較，P ＜0.05;#:與模型組比較，P ＜0.01

2.3 雌激素對MCAO大鼠BBB超微結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間TJ存在，表現(xiàn)為細(xì)胞間深染的致密條帶，內(nèi)皮細(xì)胞外雙層血管基膜連續(xù)(圖1a)。24 h模型組毛細(xì)血管周圍水腫，管腔內(nèi)有少量的細(xì)長突觸，基膜稍增厚，基膜外可見血管周細(xì)胞細(xì)胞核，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目減少，部分核膜融合消失，BBB TJ部分開放，膠質(zhì)疏松，內(nèi)皮細(xì)胞中吞飲小泡明顯增多(圖1b)。24 h雌激素組與同時間點(diǎn)模型組相比，雌激素組超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)明顯改善，毛細(xì)血管周圍水腫減輕，管腔內(nèi)突觸增多，基膜基本正常，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，可見較多的線粒體，細(xì)胞間TJ存在(圖1c)。3 d模型組:BBB TJ多處開放，表現(xiàn)為電子深染物質(zhì)減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突及毛細(xì)血管管周出現(xiàn)嚴(yán)重水腫(圖1d)。3 d雌激素組BBB TJ開放較同時間點(diǎn)模型組減輕，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突及毛細(xì)血管管周水腫較輕(圖1e)。

圖1 雌激素對MCAO大鼠BBB超微結(jié)構(gòu)的影響

2.4 Occludin蛋白的半定量分析

Western blot檢測 Occludin蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)4 h模型組Occludin蛋白表達(dá)較假手術(shù)組減弱，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。24 h模型組Occludin蛋白表達(dá)較假手術(shù)組減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3 d模型組Occludin蛋白表達(dá)進(jìn)一步減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。4 h雌激素組 Occludin蛋白表達(dá)較同時間點(diǎn)模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，24 h及3 d雌激素組Occludin蛋白表達(dá)較同時間點(diǎn)模型組比較均升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖2。

圖2 Western blot檢測Occludin蛋白表達(dá)

3 討論

BBB通透性改變是腦缺血再灌注損傷的重要途徑之一，在腦缺血再灌注損傷的病理生理過程中，BBB的損害明顯加重。研究表明TJ是保持BBB完整性的重要因素，外傷、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起TJ結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變造成BBB損害，從而導(dǎo)致BBB的通透性升高引起腦水腫［8-9］。已知的研究表明雌激素有多方面的腦保護(hù)作用，如減輕腦缺血區(qū)腦灌注量的減少、降低興奮性氨基酸(EAA)的釋放、自由基的形成、鈣通道的開放、細(xì)胞骨架的破壞、缺血再灌注損傷，改善記憶功能，增加膠質(zhì)細(xì)胞的活性及腦的反應(yīng)性修復(fù)能力等。

本實(shí)驗(yàn)主要通過雌激素預(yù)處理對去勢大鼠MCAO后不同時間點(diǎn)血腦屏障通透性的影響來進(jìn)一步闡述雌激素的腦保護(hù)作用。我們選擇了腦含水量作為觀察腦缺血再灌注后水腫程度的指標(biāo)，以腦內(nèi)伊文氏藍(lán)(EB)含量作為指示血腦屏障損傷的指標(biāo)，并結(jié)合電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)大鼠局灶性腦缺血4 h，出現(xiàn)明顯腦水腫，隨缺血時間延長，腦水腫逐漸進(jìn)展，至24 h，水腫達(dá)到高峰，與模型組比較，各治療組腦水腫均有不同程度降低，以24 h組降低最為顯著，說明雌激素能有效維護(hù)BBB的完整性，減輕腦水腫。我們通過檢查EB含量發(fā)現(xiàn)，大鼠局灶性腦缺血4 h，模型組大鼠腦組織EB含量增加，隨缺血時間延長，腦組織EB含量持續(xù)增加，至24 h，達(dá)到高峰，BBB通透性的變化與腦水腫變化一致。與同時點(diǎn)模型組比較，治療組大鼠EB含量均有不同程度降低，以24 h組降低最為顯著，說明雌激素可以通過維護(hù)BBB完整性，減輕腦水腫。

我們通過透射電鏡觀察顯示，大鼠局灶性腦缺血24 h，雌激素組超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)明顯要好于模型組，毛細(xì)血管周圍水腫相對較輕，管腔內(nèi)突觸增多，基膜基本正常，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，可見較多的線粒體，細(xì)胞間TJ存在。缺血3 d，雌激素組BBB TJ開放較模型組要少，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突及毛細(xì)血管管周水腫較輕。從以上結(jié)果來看，雌激素確實(shí)減輕了MCAO大鼠各時間點(diǎn)EB的滲透，減輕BBB內(nèi)皮細(xì)胞間TJ的開放，維護(hù)了BBB的完整性，有效減輕了腦水腫。

有研究證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接上的閉鎖蛋白表達(dá)水平存在組織分布的不均一性，在腦內(nèi)皮細(xì)胞，閉鎖蛋白呈高表達(dá)［10］，而在非神經(jīng)組織的內(nèi)皮細(xì)胞為低表達(dá)［11］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)模型組24 h組、3 d組Occludin蛋白表達(dá)較假手術(shù)組減弱，有顯著性差異，雌激素組24 h及3 d組Occludin蛋白表達(dá)較同時間點(diǎn)模型組比較均升高，有顯著性差異。說明隨缺血再灌注時間的延長，Occludin蛋白表達(dá)逐漸減少，而雌激素可上調(diào)Occludin蛋白的表達(dá)，這與Han S.Kang等的研究結(jié)果相一致［12］。以上結(jié)果提示缺血再灌早期可能主要為細(xì)胞源性水腫，緊密連接尚未開放，隨缺血再灌注時間的延長，緊密連接大量開放，血腦屏障完整性被破壞，血管源性腦水腫占主導(dǎo)地位。

雌激素可以減少緊密連接開放，改善血腦屏障完整性，我們分析可能原因有:①減少鈣通道的開放。鈣離子參與了各種細(xì)胞間連接的形成，并且對TJ正常功能的維持起了重要作用［13］，無論是細(xì)胞內(nèi)的鈣還是細(xì)胞外的鈣離子都能夠?qū)J的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。而雌激素可減少細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流，維持線粒體的鈣負(fù)荷及其正常功能［14］。②TJ破壞后，其形成或再形成與Occludin磷酸化升高有關(guān)，尤其是發(fā)生在絲氨酸和酪氨酸殘基上的磷酸化，谷氨酸增加Occludin蛋白酪氨酸的磷酸化，減少蘇氨酸的磷酸化，而雌激素能降低腦缺血時細(xì)胞外谷氨酸的含量，抑制NMDA受體的過度激活，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取，從而減少TJ的破壞。③膠質(zhì)細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞間TJ的形成有著重要影響，它在一定程度上加強(qiáng)、支持了屏障功能。④研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)除了對單核白細(xì)胞具有趨化活性以外，還能夠下調(diào)TJ蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)［15］。而雌激素能抑制MCP-1的表達(dá)及一些炎性因子表達(dá)［16］。

綜上所述，通過實(shí)驗(yàn)，我們觀察到雌激素可改善BBB超微結(jié)構(gòu)，上調(diào)TJ occludin蛋白的表達(dá)，維護(hù)BBB的完整性，有效減輕腦水腫，進(jìn)一步探討了雌激素作為神經(jīng)元保護(hù)劑可有效改善微血管的結(jié)構(gòu)，但其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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