周紅艷　郭艷風(fēng)

【摘要】 目的：探討缺氧誘導(dǎo)因子2α（HIF-2α）在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及其意義。方法：通過原位雜交（ISH）技術(shù)檢測(cè)102例宮頸鱗癌組織、66例CIN組織和40例正常宮頸組織中HIF-2α mRNA的表達(dá)情況及其與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：HIF-2α mRNA在宮頸鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常宮頸組織和CIN組織（P<0.05），并且HIF-2α mRNA在宮頸鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（字2=6.766，P=0.009）和臨床分期（字2=11.639，P=0.001）相關(guān)，而與年齡、病理組織學(xué)分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)（P>0.05）。結(jié)論：HIF-2α mRNA在宮頸鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能與宮頸鱗癌的發(fā)生和演進(jìn)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 缺氧誘導(dǎo)因子2α； 宮頸鱗癌； 原位雜交

在全球范圍內(nèi)，宮頸癌是女性第3大常見惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命[1]。宮頸鱗癌是宮頸癌最常見的病理類型，本研究通過原位雜交（in situ hybridization，ISH）技術(shù)檢測(cè)宮頸鱗癌組織、CIN組織和正常宮頸組織中缺氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxia-inducible factor 2α，HIF-2α）mRNA的表達(dá)情況及其與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，旨在探討HIF-2α在宮頸鱗癌發(fā)生與演進(jìn)中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2006年3月-2012年3月在本院住院患者的宮頸組織蠟塊208例，術(shù)前患者均未接受放療及化療?；颊吣挲g在34～65歲，平均（45.8±3.5）歲。其中包括宮頸鱗癌102例、CIN組66例、正常宮頸組織40例。

1.2 臨床病理資料 宮頸組織蠟塊共208例，術(shù)前患者均未接受放療及化療。（1）宮頸鱗癌組：102例，術(shù)前均經(jīng)宮頸活組織病理證實(shí)。其中淺肌層浸潤(rùn)癌42例，深肌層及以上浸潤(rùn)癌60例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的18例；術(shù)后病理組織學(xué)分級(jí)（按照WHO分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)）：其中高分化32例，中分化44例、低分化26例；臨床分期，Ⅰ期56例，Ⅱ期21例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例；（2）CIN組：66例，其中CIN-Ⅰ級(jí)12例，CIN-Ⅱ級(jí)24例，CIN-Ⅲ級(jí)30例；（3）正常宮頸組織組：同期住院因子宮良性疾病行子宮全切術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)宮頸正常者40例。

1.3 主要試劑及試劑盒 DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，人原位雜交檢測(cè)試劑盒（MK2210h）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，5端地高辛標(biāo)記的HIF-2α寡核苷酸探針序列：5-GAAGC TGACC AGCAG ATGGA CAACT TGTAC CTGAA-3，由武漢博士德生物工程有限公司合成。

1.4 ISH染色 石蠟切片經(jīng)新鮮配置的二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，用新鮮配制的3% H2O2室溫處理5～10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37 ℃消化20 min，消化標(biāo)本DNA結(jié)合蛋白，1%多聚甲醛/0.1 M PBS（pH7.2～7.6），室溫固定10 min，每張切片加20 μL不含探針的預(yù)雜交液，恒溫箱40 ℃ 4 h，每張切片加20 μL含探針的雜交液，恒溫箱40 ℃雜交過夜，雜交后洗滌，滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化過氧化物酶，PBS清洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 ISH結(jié)果判定 HIF-2α陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)；參照文獻(xiàn)[2]，原位雜交的陽(yáng)性計(jì)算方法為：于高倍鏡下（×400）隨即選取10個(gè)視野（每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè)），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<30%、30%～70%、>70%分別記1、2、3分。陽(yáng)性著色強(qiáng)度：雜交信號(hào)強(qiáng)度可分為弱（+）、中（++）、強(qiáng)（+++）三級(jí)，分別記1、2、3分：1分為弱陽(yáng)性（+）：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見淺黃色顆粒，明顯高于背景底色。2分為陽(yáng)性（++）：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見黃色顆粒。3分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量棕黃色顆粒。上述2種記分相乘，<2分者為陰性，≥2分者為陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，兩樣本率的比較采用四格表資料的 字2檢驗(yàn)，多樣本率的比較采用行列表資料的 字2檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織中HIF-2α mRNA的表達(dá) HIF-2α mRNA在正常宮頸組織、CIN和宮頸鱗癌組織中陽(yáng)性率分別為0、22.7%（15/66）、68.6%（70/102），三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=68.005，P<0.05），且兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HIF-2α mRNA在正常宮頸、CIN和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)見圖1～圖3。

2.2 HIF-2α mRNA的陽(yáng)性表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系 伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中HIF-2αmRNA的陽(yáng)性表達(dá)率較高（P<0.05）；宮頸鱗癌的臨床分期越晚，HIF-2αmRNA的陽(yáng)性表達(dá)率越高（P<0.05）。HIF-2α mRNA在宮頸鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率與年齡、病理組織學(xué)分化程度和浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)（P>0.05），見表1。

3 討論

HIF是廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，目前發(fā)現(xiàn)的缺氧誘導(dǎo)因子成員有HIF-1、HIF-2、HIF-3 3種。HIF-2是由HIF-2α和HIF-1β兩個(gè)亞基構(gòu)成的異源二聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物，HIF-2α和HIF-1β均為堿性螺旋-環(huán)-螺旋-PAS（bHLH-PAS）轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。

研究已證實(shí)，HIF-2α在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如結(jié)直腸癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱移行細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等，由此推測(cè)HIF-2α可能為一個(gè)癌基因[3-9]。本研究顯示，正常宮頸組織中與CIN組織中HIF-2α mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CIN組織中與宮頸鱗癌組織中HIF-2α mRNA陽(yáng)性表達(dá)率兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明HIF-2α的表達(dá)可能在宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。Mandriota等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在腎透明細(xì)胞癌中檢測(cè)到較高的HIF-2α表達(dá)，并且表達(dá)的增加與進(jìn)展期腫瘤的損害程度有關(guān)。Turner等[11]在研究HIF-2α與腎癌血管化和VHL基因突變的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，17例透明細(xì)胞癌中有11例HIF-2α mRNA表達(dá)水平增高，與相應(yīng)的正常組織相比有顯著差異，以上結(jié)果均表明HIF-2α表達(dá)的增高與腎透明細(xì)胞癌有顯著相關(guān)性，與本研究結(jié)果相似。endprint

此外，本研究還分析了HIF-2α mRNA的表達(dá)與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等主要臨床病理學(xué)特征間的關(guān)系，結(jié)果顯示 HIF-2α mRNA的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)（P<0.05），而與年齡、病理組織學(xué)分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)（P>0.05），由這一結(jié)果進(jìn)一步推測(cè)HIF-2α的高表達(dá)可能與宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。用RNAi技術(shù)干擾乳腺癌細(xì)胞中HIF-2α的表達(dá)后，癌細(xì)胞凋亡顯著增多[12]。Liu等[13]用RNAi技術(shù)干擾NSCLC（非小細(xì)胞肺癌）癌細(xì)胞中HIF-2α的表達(dá)，可以明顯抑制癌細(xì)胞的侵襲、粘附和轉(zhuǎn)移，推測(cè)可能跟HIF-2α上調(diào)趨化因子受體4的表達(dá)有關(guān)。在乳腺癌中，HIF-2α高表達(dá)與腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)，HIF-2α表達(dá)越高，越易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且HIF-2α表達(dá)與MMP-2的表達(dá)正相關(guān)[14]。Petrella等[15]在轉(zhuǎn)移性腎癌中發(fā)現(xiàn)HIF-2α可以誘導(dǎo)MT1-MMP的表達(dá)。MMP有明顯的促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，因此HIF-2α有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。在甲狀腺乳頭狀癌中，HIF-2α表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、腫瘤大小、TNM分期無(wú)關(guān)[16]。此結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，提示HIF-2α可能在宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，參與了宮頸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，并可能成為宮頸鱗癌一個(gè)新的分子治療靶點(diǎn)。

綜上所述，HIF-2α的高表達(dá)可能與宮頸鱗癌的發(fā)生和演進(jìn)存在密切的關(guān)系；檢測(cè)HIF-2α的表達(dá)水平，可對(duì)宮頸鱗癌進(jìn)行早期診斷和治療觀察，但其在宮頸鱗癌中的作用尚需進(jìn)一步探討，這對(duì)完善宮頸癌的致癌機(jī)制及指導(dǎo)治療具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[2]王伯沄，李玉松，黃高昇，等.病理學(xué)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：354-366，565-596.

[3] Xue X，Taylor M，Anderson E，et al.Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis[J].Cancer Res，2012，72（9）：2285-2293.

[4] Wang Y，Li Z，Zhang H，et al.HIF-1alpha and HIF-2alpha correlate with migration and invasion in gastric cancer[J].Cancer Biol Ther，2010，10（4）：376-382.

[5] Wu X H，Qian C，Yuan K.Correlations of hypoxia-inducible factor-1alpha/hypoxia-inducible factor-2alpha expression with angiogenesis factors expression and prognosis in non-small cell lung cancer[J].Chin Med J （Engl），2011，124（1）：11-18.

[6] Onita T，Ji P G，Xuan J W，et al.Hypoxia-induced， perinecrotic expression of endothelial Per-ARNT-Sim domain protein-1/hypoxi-a-inducible factor-2alpha correlates with tumor progression， vascularization， and focal macrophage infiltration in bladder cancer[J].Clin Cancer Res，2002，8（2）：471-480.

[7] Wright T M，Rathmell W K.Identification of Ror2 as a hypoxia-inducible factor target in von Hippel-Lindau-associated renal cell carcinoma[J].J Biol Chem，2010，285（17）：12 916-12 924.

[8] Giatromanolaki A，Sivridis E，F(xiàn)iska A，et al.Hypoxia-inducible factor-2 alpha （HIF-2 alpha） induces angiogenesis in breast carcinomas[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol，2006，14（1）：78-82.

[9] Zhu G Q，Tang Y L，Li L，et al.Hypoxia inducible factor 1alpha and hypoxia inducible factor 2alpha play distinct and functionally overlapping roles in oral squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res，2010，16（19）：4732-4741.

[10] Mandriota S J，Turner K J，Davies D R，et al.HIF activation identifies early lesions in VHL kidneys： evidence for site specific tumor suppressor function in the nephron[J].Cancer Cell，2002，1（2）：459-468.endprint

[11] Turner K J，Moore J W，Jones A，et al.Expression of hypoxia-inducible factors in human renal cancer： relationship to angiogenesis and to the von Hippel Lindau gene mutation[J].Cancer Res，2002，62（12）：2957-2961.

[12] Kim R J，Park J R，Roh K J，et al.High aldehyde dehydrogenase activity enhances stem cell features in breast cancer cells by activating hypoxia-inducible factor-2alpha[J].Cancer Lett，2013，333（1）：18-31.

[13] Liu Y L，Yu J M，Song X R，et al.Regulation of the chemokine receptor CXCR4 and metastasis by hypoxia-inducible factor in non small cell lung cancer cell lines[J].Cancer Biol Ther，2006，5（10）：1320-1326.

[14] Wang H X，Qin C，Han F Y，et al.HIF-2alpha as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J].Genet Mol Res，2014，24（13）：45-48.

[15] Petrella B L，Lohi J，Brinckerhoff C E.Identification of membrane type-1 matrix metalloproteinase as a target of hypoxia-inducible factor-2 alpha in von Hippel-Lindau renal cell carcinoma[J].On-cogene，2005，24（6）：1043-1052.

[16] Wang N，Luo H J，Yin G B，et al.Overexpression of HIF-2alpha， TWIST， and CXCR4 is associated with lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma[J].Clin Dev Immunol，2013，2013：589 423.

（收稿日期：2014-05-19） （本文編輯：蔡元元）endprint

[11] Turner K J，Moore J W，Jones A，et al.Expression of hypoxia-inducible factors in human renal cancer： relationship to angiogenesis and to the von Hippel Lindau gene mutation[J].Cancer Res，2002，62（12）：2957-2961.

[12] Kim R J，Park J R，Roh K J，et al.High aldehyde dehydrogenase activity enhances stem cell features in breast cancer cells by activating hypoxia-inducible factor-2alpha[J].Cancer Lett，2013，333（1）：18-31.

[13] Liu Y L，Yu J M，Song X R，et al.Regulation of the chemokine receptor CXCR4 and metastasis by hypoxia-inducible factor in non small cell lung cancer cell lines[J].Cancer Biol Ther，2006，5（10）：1320-1326.

[14] Wang H X，Qin C，Han F Y，et al.HIF-2alpha as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J].Genet Mol Res，2014，24（13）：45-48.

[15] Petrella B L，Lohi J，Brinckerhoff C E.Identification of membrane type-1 matrix metalloproteinase as a target of hypoxia-inducible factor-2 alpha in von Hippel-Lindau renal cell carcinoma[J].On-cogene，2005，24（6）：1043-1052.

[16] Wang N，Luo H J，Yin G B，et al.Overexpression of HIF-2alpha， TWIST， and CXCR4 is associated with lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma[J].Clin Dev Immunol，2013，2013：589 423.

（收稿日期：2014-05-19） （本文編輯：蔡元元）endprint

[11] Turner K J，Moore J W，Jones A，et al.Expression of hypoxia-inducible factors in human renal cancer： relationship to angiogenesis and to the von Hippel Lindau gene mutation[J].Cancer Res，2002，62（12）：2957-2961.

[12] Kim R J，Park J R，Roh K J，et al.High aldehyde dehydrogenase activity enhances stem cell features in breast cancer cells by activating hypoxia-inducible factor-2alpha[J].Cancer Lett，2013，333（1）：18-31.

[13] Liu Y L，Yu J M，Song X R，et al.Regulation of the chemokine receptor CXCR4 and metastasis by hypoxia-inducible factor in non small cell lung cancer cell lines[J].Cancer Biol Ther，2006，5（10）：1320-1326.

[14] Wang H X，Qin C，Han F Y，et al.HIF-2alpha as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival[J].Genet Mol Res，2014，24（13）：45-48.

[15] Petrella B L，Lohi J，Brinckerhoff C E.Identification of membrane type-1 matrix metalloproteinase as a target of hypoxia-inducible factor-2 alpha in von Hippel-Lindau renal cell carcinoma[J].On-cogene，2005，24（6）：1043-1052.

[16] Wang N，Luo H J，Yin G B，et al.Overexpression of HIF-2alpha， TWIST， and CXCR4 is associated with lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma[J].Clin Dev Immunol，2013，2013：589 423.

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