楊垚 張艷 黨江波 梁國魯 郭啟高 龐靜

摘 ?要：為使煙草染色體標本制備過程中取材更方便，本研究以異源五倍體煙草（2n=5x=58）為材料，觀察了不同大小子房、不同預處理方法對煙草染色體制片效果的影響。首先，子房大小按花冠與花萼長度比例分為6類;其次，預處理方法分為2類，即：（1）室溫下于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中預處理2、4和6 h;（2）7 ℃下于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中預處理12、24和36 h。結果顯示，當花冠長度小于或等于花萼長度的1/2時，子房中分裂期細胞的比例最大，為97.00±17.82個/1000個。該時期子房于7 ℃經24 h預處理后，染色體數目與形態(tài)清晰可辨。利用上述方法制作云煙87（2n=4x=48）和（2n=2x=20）的染色體標本，均獲得較好的結果。此外，將上述方法制作的五倍體煙草染色體經5S rDNA-FISH，獲得了清晰可辨的5個不同信號，與預期一致?？梢姡啄圩臃靠捎糜跓煵萑旧w標本的制作，且用改良的預處理方法制備的染色體標本可用于染色體計數和核型分析，也可用于原位雜交分析。

關鍵詞：煙草;幼嫩子房;染色體制片;原位雜交

中圖分類號：S572.03 ?????????文章編號：1007-5119（2019）04-0056-06 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.04.009

Study on ?Chromosome Specimen?Preparation Using Ovary

YANG Yao， ZHANG Yan， DANG Jiangbo， LIANG Guolu， GUO Qigao， PANG Jing

（1. College of Horticulture and Landscape， Southwest University， Chongqing 400715， China; 2. Chongqing Tobacco Research Institute， Chongqing Municipal Tobacco Company， Chongqing 400715， China; 3. Zunyi Tobacco Company of Guizhou Province， Meitan Branch， Zunyi， Guizhou 564100， China）

?In order to obtain materials of ?plants easily when preparing chromosome?specimens， in this study， allopentaploid tobacco （2n=5x=58） was used as materials to observe?the effects of ovary?sizes and pretreatment methods on ?plants chromosome specimen preparation. First， ovaries were divided?into?6 types based on corolla length/calyx length; and then， two pretreatments were compared， one was pretreatment in 0.002 mol/L 8-hydroxy-quinoline solution at normal atmospheric temperature for 2， 4?and 6 h， the other one was pretreatment in 0.002 mol/L 8-hydroxy-quinoline solution at 7 ℃?for 12， 24 and 36 h. When the length of the corolla was less than or equal to 1/2 of the calyx， the ratio of mitotic cells reached the highest， being?97.00±17.82 in 1000 cells. When ovaries with the most mitotic cells were pretreated at 7 ℃?for 24 h， the number and configuration of chromosomes were clear and distinguishable. The above mentioned?methods?were?applied in chromosome specimen preparation of Yunyan87 （2n=4x=48） and ?（2n=2x=20）， and nice results were obtained， respectively. In addition， 5S rDNA-FISH?was carried out on chromosomes of ，?and?expected recognizable signals were found on 5 different chromosomes. These results indicated that tender?ovary could be used to prepare chromosome specimens of ?plants. Chromosome?specimens prepared with modified method were not only beneficial to chromosomes counting?and karyotype analysis， but also can be applied to in situ hybridization analysis.

?; tender ovary; chromosome specimen preparation; in situ hybridization

染色體是基因的載體，其數目和形態(tài)是生物的主要特征。根據染色體的數目和形態(tài)，可對生物的進化和分類進行研究。在生物育種中也常涉及對染色體數目、形態(tài)的觀察。染色體標本制作是染色體觀察和研究的基礎，對生物研究和育種均較為重要。染色體標本制作時需選取生長旺盛的組織為

材料，如幼嫩根尖、幼嫩莖尖以及幼嫩葉片等，其中，種子萌發(fā)的根尖較為常用。

煙草為茄科（Solanaceae）煙草屬（）植物的通稱，煙草染色體制片主要以種子萌發(fā)的根尖和幼苗的根尖為材料。然而對于煙草屬植物，無論是種子萌發(fā)的根尖還是幼苗的根尖均較為細小，取材難度較大，后續(xù)處理過程中材料較易丟失，且切取根尖易對植株造成傷害，在單株材料的染色體分析中不宜應用。幼嫩花蕾（子房）在部分植物中被用于染色體標本的制備，而未見在煙草中應用。煙草花量較多，花期較長，取材方便，且取花蕾對植株的傷害較小，也不影響后續(xù)的結實以及雜交等環(huán)節(jié)，這有利于數量較少且較為珍貴的材料的染色體制備。

本研究以煙草屬異源五倍體植株為材料，對利用花蕾（子房）進行煙草染色體制片的可行性進行分析，為煙草染色體標本的制作提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

煙草四倍體材料云煙87（2n=4x=48）、煙草二倍體材料（2n=2x=20）由國家煙草種質資源中期庫提供。煙草異源五倍體（2n=5x=58）材料是以云煙87八倍體（2n=8x=96）為母本與為父本雜交，經組織培養(yǎng)繁育獲得。所有材料均種植于西南大學園藝園林學院試驗基地。

1.2 ?方法

1.2.1??不同大小子房中分裂期細胞的比例觀察?根據前期的觀察與測量，按花冠與花萼長度的比例將異源五倍體煙草的子房分為6類（表1）。于晴天在上午9：00—11：00取下6種不同類型的花蕾，自花托和子房連接處用鋒利刀片分割，將子房去花柱后置于卡諾固定液（∶=1∶3）中固定過夜。取出后用蒸餾水清洗2次，并于第3次清洗過程中浸泡約20 min以去除固定液。后將子房分割為約1 mm的組織塊，放入混合酶液（3%纖維素酶+0.3%果膠酶）中于37 ℃下孵育1.5 h。蒸餾水輕柔清洗2次以去除酶液，加卡諾固定液固定。采用壓片法觀察，記錄處于分裂期的細胞數量和觀察細胞總數量，計算分裂期細胞的比例。每類花蕾5個重復。

1.2.2??不同方法預處理及染色體制備??取有絲分裂細胞占比最大的異源五倍體花蕾類型，按前述方法分割后取子房浸沒于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中，按以下2類方法進行預處理：

（1）在室溫（約25 ℃）條件下分別處理2、4和6 h。

（2）在7 ℃條件下分別處理12、24和36 h。

預處理后用卡諾固定液固定過夜，再按前述方法酶解，以涂片法進行制片，火焰干燥，5%吉姆薩染色。各處理5個重復，經鏡檢統(tǒng)計中期分裂相細胞的比例，觀察染色體形態(tài)，并以此對不同預處理方法進行評價。

云煙87和的子房按最佳方法進行預處理。

1.2.3??5S rDNA原位雜交??（1）5S rDNA探針制備：供試探針自擬南芥5S rDNA序列中選取，由上海生工生物工程公司合成，并利用TAMRA（四甲基羅丹明）對其5'端進行修飾。（2）原位雜交方法：參照陳志的方法進行，依次是染色體標本的預處理與固定、探針和染色體的變性、雜交、雜交后洗脫、信號檢測與圖像處理。其中不同的是：雜交過程中探針終濃度為2?ng/μL，直接以2×SSC溶液配制，不經變性直接進行雜交，雜交時間為2?h;雜交后直接用2×SSC在常溫下洗脫2次。

2 ?結??果

2.1 ?不同大小子房中分裂期細胞數量

不同大小子房中處于分裂期的細胞比例見表2。由表2中可見，第2類子房即花冠長度小于等于花萼長度的1/2的子房中分裂期細胞占比最大，每1000個細胞中有97.00±17.82個（圖1），與其他類型子房中的比例相比差異顯著或極顯著;其次是第3類和第4類子房。但第3類與第4類子房相比差異不顯著?？梢?，第2類子房最適于染色體標本制備。

2.2 ?不同方法預處理子房制片效果

表3所示，同一方法在不同溫度下，隨著預處理時間的增加，制片中中期分裂相的細胞數目均增加，最長染色體的長度縮短，染色體的縊痕逐漸明顯，著絲點顯現出來。

室溫條件下，異源五倍體煙草經2 h預處理，最長染色體的長度為10.30～15.24 μm，大部分染色體邊緣模糊，著絲點未見，著色較淺。經4 h（圖2B）、6 h預處理，雖部分染色體著絲點顯現，但邊緣較模糊，形態(tài)仍較難清晰分辨。在7 ℃下，經12 h預處理，大部分染色體著絲點已經顯現，邊緣較清晰，但長度稍長;24 h預處理（圖2A），所有染色體著絲點清晰可見，邊緣清晰，長度適中，且分散性較好。在處理36 h后，大部分可見染色單體，但染色體長度較短，過度凝縮，亦不利于形態(tài)識別和測量。

2.3 ?云煙87和制片

以子房為材料，經7 ℃預處理24 h后對云煙87和進行染色體制片。從制片結果中可以看出，兩種煙草的染色體均較分散，形態(tài)舒展，邊緣清晰，可用于計數和核型分析（圖3）。

圖3 ?以子房為材料及用改良的預處理方法制得的云煙87（A）和（B）的染色體

Fig. 3 ?Chromosomes of Yunyan87 and ?using ovaries as materials pretreated for 24 h at 7 ℃

2.4 ?異源五倍體煙草5S rDNA原位雜交效果

將最佳方法制備的異源五倍體煙草染色體標本用于5S rDNA原位雜交。圖4結果顯示，雜交信號亮度較明顯，易于識別。該中期染色體上共有5個5S rDNA雜交信號，與預期相符合。說明采用上述最佳方法所制的異源五倍體煙草染色體標本可用于原位雜交。

3 ?討??論

花蕾由莖尖分生組織分化發(fā)育而來，幼嫩花蕾快速生長、膨大，這是幼嫩花蕾可用于進行染色體制片的主要原因。不同時期處于分裂期的細胞比例不同，說明不同時期花蕾的生長速度不同。染色體制片過程中，常采用單一方法進行預處理，其中秋水仙素和8-羥基喹啉較為常用，低溫誘導也有見報道。低溫處理可間接地對蛋白質的結構起穩(wěn)定作用，這樣有助于后期觀察染色體的形態(tài)。本研究采用化學試劑結合低溫誘導，效果較單一化學試劑處理較好。且低溫處理的染色體長度分布范圍較常溫處理的小，表明低溫處理使染色體長度較均一。這可能是低溫使整個花蕾在短時間處于同一條件，還延緩了花蕾的生長活動，使8-羥基喹啉更充分地滲入所有細胞，以使更多細胞所處條件更趨于一致。

原位雜交在煙草遠緣雜交育種以及煙草屬植物的進化、分類中有較多應用。原位雜交要求分裂相背景較少，染色體形態(tài)舒展。在本研究中，以20 bp的5S rDNA保守序列為探針，進行雜交，雜交后的分裂相背景淺，染色體形態(tài)清晰可辨，所獲得的信號也較強，且數量與預期一致。這說明，這種方法獲得的染色體適于原位雜交，對較短的探針序列也較為實用，且效果良好。這為后續(xù)煙草屬植物細胞遺傳學分析過程中的染色體制備提供了較好的方法。

煙草育種特別是遠緣雜交育種過程中常涉及重要單株材料的染色體鑒定和分析。這類分析過程中，往往面臨材料較少的問題，且這類分析對制片的效果要求也較高。本研究所得結果為這類材料的?單株染色體制備提供了較好的方法。該方法在云煙87和N. plumbaginifolia及二者的雜種（異源五倍體）?材料中均有較好效果，表明這種方法有較為廣泛?的應用范圍。較多野生煙草的子房較小，如本研究 中所用的，處于最佳時期的子房的長度僅1～2 mm。這增加了部分處理過程的難度。為了取材和處理方便，在預處理時可將包含多個花蕾的花序一起放入預處理液中處理。

但是，以花蕾為材料制備染色體標本，不能對材料進行早期鑒定。一方面周期較長，另一方面對場地面積有較多要求。故本方法并不太適于大規(guī)模篩選、鑒定以及對純系材料的早期鑒定。大規(guī)模篩選、鑒定可結合其他方法如流式細胞術、氣孔保衛(wèi)細胞觀察等進行初選，再用本研究所得方法進行后期鑒定。

綜上所述，本研究的最佳方法適于煙草染色體標本的制作，且制片可用于分子細胞遺傳學實驗中，這為煙草的細胞遺傳學分析提供參考。

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