張麗珍　周之榮

[摘要] 目的 建立四味清口含片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。 方法 采用薄層色譜法（TLC）定性鑒別四味清口含片中的桂心、甘草、細(xì)辛、廣陳皮，采用高效液相色譜法（HPLC）測定四味清口含片中桂皮醛的含量。色譜條件為Hypersil ODS（C18）色譜柱（4.6mm× 250mm，5μm），檢測波長為290 nm，流動(dòng)相為甲醇–φ=0.1 %磷酸水溶液（35∶65，v/v），流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，理論板數(shù)以桂皮醛峰計(jì)算不低于3000。 結(jié)果 TLC法能分別檢出四味清口含片中桂心（肉桂）、甘草、細(xì)辛、廣陳皮，均具有良好的鑒別特征，陰性未見干擾；桂皮醛進(jìn)樣量在0.010～0.500μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，r=0.9999。在精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)中峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.03%、1.27%、1.23%。加樣回收率為97.23%～101.54%，平均值為99.43%，RSD為0.99% （n=9）。 結(jié)論 本方法具有良好的專屬性和重現(xiàn)性，加樣回收率試驗(yàn)符合要求，能準(zhǔn)確、穩(wěn)定地對(duì)四味清口含片進(jìn)行定性鑒別和定量測定，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 四味清口含片；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 薄層色譜法；高效液相色譜法；桂皮醛；含量測定

[中圖分類號(hào)] R284.1， R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）17-18-05

[Abstract] Objective To establish the quality control standard of Siweiqing buccal tablets. Methods Thin layer chromatography （TLC） was used to identify Cortex Cinnamomi， radix glycyrrhizae， Citrus Chachiensis Hortorum and Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.） Kitag. in these tablets preparation. The high performance liquid chromatography （HPLC） was adopted to determine the content of cinnamaldehyde. The chromatographic conditions were as follows： the chromatographic column Hypersil ODS（C18）column （4.6mm×250mm， 5μm）， the detection wavelength of 290nm， the mobile phase of methanol–φ=0.1% phosphoric acid （35∶ 65， v/v）， the flow velocity of 1.0mL/min， the column temperature at 30℃， the theoretical plate number no less than 3000. Results Citrus Chachiensis Hortorum， radix glycyrrhizae， Cortex Cinnamomi and Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.） Kitag. can be identified by TLC without interference of negative samples. The linear relationship between content of cinnamaldehyde and peak area was obtained during the range of 0.010-0.500μg， r=0.999 9. RSD's found of the peak area for the precision test， the stability test and the repeatability test were 1.03%， 1.27% and 1.23%， respectively. The recoveries of cinnamaldehyde obtained were in the range of 97.23%-101.54% and the average of 99.43% with RSD of 0.99% （n=9）. Conclusion The method can be applied to qualitative identification and quantitative assay of Siweiqing buccal tablets with good reproducibility. The sampling recovery test is in compliance with the requirement. The quality standard can effectively control the quality of Siweiqing buccal Tablets with good specificity， reproducibility and stability. It can be applied to the quality control of Siweiqing buccal tablets.

[Key words] Siweiqing buccal tablets； Quality standards； TLC； HPLC； Cinnamaldehyde； Content determinationendprint

四味清口含片處方源于《華佗神方》，由桂心、甘草、細(xì)辛、廣陳皮組成。該方理氣和胃，陽通胃氣和降，芳香化濁除臭，具有防治口臭等功效[1]。由于

處方中有幾味中藥的口感不好，為方便患者服用，豐富臨床用藥劑型，本課題組研制了能在口腔內(nèi)緩緩溶化而發(fā)揮對(duì)口臭治療作用的口含片。為有效控制四味清口含片產(chǎn)品質(zhì)量，保證其用藥安全有效，進(jìn)行了定性定量研究，對(duì)口含片中桂心（肉桂）、甘草、細(xì)辛、廣陳皮進(jìn)行了薄層色譜鑒別，建立其定性鑒別方法；采用高效液相色譜法建立該制劑主藥桂心（肉桂）所含主要有效成分桂皮醛的含量測定方法，并對(duì)3批樣品進(jìn)行了含量測定。

1 材料與儀器

1.1 材料

四味清口含片（批號(hào)：20130501、20130510、20130520）由本實(shí)驗(yàn)室自制；廣陳皮采于廣東省江門市新會(huì)區(qū)，經(jīng)鑒定為茶枝柑（Citrus reticulatae“Chachi”）的干燥成熟果皮。將藥材于50℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重后粉碎，過50目篩，保存在干燥器皿內(nèi)；橙皮苷（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110721-200613）；川陳皮素、橘皮素自制，經(jīng)過1H-NMR、13C-NMR、MS等光譜技術(shù)及理化鑒定確定其結(jié)構(gòu)，與參考文獻(xiàn)核對(duì)數(shù)據(jù)一致，并經(jīng)HPLC峰面積歸一化法測定純度達(dá)98%以上；甘草對(duì)照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)120904-201016）；甘草酸銨對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110731-201116）；肉桂對(duì)照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)121316-200401）；桂皮醛對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110710-201012）；北細(xì)辛對(duì)照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)121204-201104）；細(xì)辛脂素對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)111889-201203）；甲醇為色譜醇；磷酸。實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器

Ultimate 3000高效液相自動(dòng)進(jìn)樣色譜儀，紫外檢測器（Dionex Corp.）；CPA225D電子分析天平（Sartorius Corp.）；KQ-300VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；U-3010型紫外可見分光光度計(jì)（日本日立公司）。

2 薄層色譜定性鑒別方法及結(jié)果

2.1 桂心TLC鑒別

取本品10片，研細(xì)，取粉末0.5g，加入乙醇10mL，冷浸20min，時(shí)時(shí)振搖，濾過，取濾液作為供試品溶液。稱取桂心（肉桂）對(duì)照藥材粉末0.5g，同法制備對(duì)照藥材溶液。另按處方工藝制備缺桂心的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。取桂皮醛對(duì)照品，加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》（2010版）一部附錄VIB）試驗(yàn)：硅膠G薄層板（20cm×10cm），分別移取供試品溶液、對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性樣品溶液為5μL、2μL、5μL、5μL，點(diǎn)狀點(diǎn)樣。以石油醚（60～90℃）–醋酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開約8cm，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液，供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性樣品則無相應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見封三圖1。

2.2 甘草TLC鑒別

取本品 10 片，研細(xì)，取粉末2g，加乙醚40mL，加熱回流1h，濾過，棄去醚液，殘?jiān)蛹状?0mL，加熱回流1h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL溶解，用正丁醇提取3 次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次（每次3mL），蒸干正丁醇液，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。稱取甘草對(duì)照藥材粉末1g，同法制備對(duì)照藥材溶液。另按處方工藝制備缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備甘草陰性對(duì)照溶液。再取甘草酸銨對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VIB）試驗(yàn)：吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液及對(duì)照藥材溶液各1～2μL，分別點(diǎn)于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙醋–甲酸–冰醋酸–水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。經(jīng)對(duì)三批供試品進(jìn)行檢測，供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。陰性樣品則無相應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見封三圖2。

2.3 細(xì)辛TLC鑒別

取本品10片，研細(xì)，取粉末0.5g，加甲醇20mL，超聲處理45min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，作為供試品溶液。取北細(xì)辛對(duì)照藥材粉末0.5g，同法制備對(duì)照藥材溶液。另按處方工藝制備缺細(xì)辛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。再取細(xì)辛脂素對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[《中國藥典》（2010版）一部附錄VI B]試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90℃）–醋酸乙酯（3∶1）為展開劑，飽和15min，展開30min（展距為10cm），取出，室溫下晾干，置紫外燈（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品則無相應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見封三圖3。

2.4 廣陳皮TLC鑒別

陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，藥材可分為陳皮和廣陳皮[2]。廣陳皮的原植物為茶枝柑（Citrus reticulatae-Chachi.），主產(chǎn)于廣東新會(huì)，又名新會(huì)陳皮，為廣東傳統(tǒng)著名道地藥材，具有理氣健脾、燥濕化痰等功效。除揮發(fā)油外，廣陳皮主含黃酮類成分。其黃酮類成分有兩大類型：一類是黃酮苷類，主要為二氫黃酮類成分，如橙皮苷、柚皮苷等；一類是多甲氧基黃酮類，主要有川陳皮素、橘皮素、3，5，6，7，8，3，4-七甲氧基黃酮等。橙皮苷具有抗脂質(zhì)氧化、清除氧自由基、抗炎、抗病毒、抗癌、抗菌、延緩衰老等作用[3-4]。此外，多甲氧基黃酮類成分有抗癌[5-6]、抗真菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化和降低血清膽固醇[7-8]等藥理活性。廣陳皮中所含黃酮類成分以橙皮苷的含量為最高，其次是多甲氧黃酮類成分，該類成分又以川陳皮素和橘皮素的含量為高[9]。endprint

本實(shí)驗(yàn)選擇廣陳皮中含量最高的兩個(gè)多甲氧基黃酮川陳皮素、橘皮素結(jié)合橙皮苷作為TLC定性鑒定組分，與《中國藥典》（2010年版）里采用橙皮苷單組分鑒定相比，能更全面地反映廣陳皮道地性的特色，為廣陳皮藥材質(zhì)量控制提供了新的參考。

取本品10片，研細(xì)，取粉末2g，加入甲醇，超聲提取3次（加入溶劑體積分別為10、10、5mL），每次提取30min，4000r/min離心5min，取上清液，揮干后加甲醇溶解并定容至25mL，作為供試品溶液。稱取廣陳皮原藥材粉末0.5g，同法制備原藥材溶液。另按處方工藝制備缺廣陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。稱取25.0mg橙皮苷、3.0mg川陳皮素和2.0mg橘皮素，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容。配制成每毫升含2.5mg橙皮苷、0.3mg。川陳皮素和0.2mg橘皮素的混合對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》（2010版）一部附錄VI B）試驗(yàn)：硅膠G高效薄層板（20cm×10cm），點(diǎn)狀點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量2μL。先以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開劑，展開約3cm，取出，晾干，再以甲苯–乙酸乙酯–甲酸–水（20∶10∶1∶1）的上層溶液為展開劑，展至約8cm，取出，晾干，噴以5%AlCl3乙醇溶液，于365nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品及原藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性樣品則無相應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見封三圖4。

3 含量測定

3.1 含量測定指標(biāo)的確定

方中桂心為君藥，桂心為肉桂加工過程中檢下的邊條除去栓皮者，主要含揮發(fā)油桂皮醛等成分。桂皮醛能抑制胃腸平滑肌的痙攣而有解痙止痛功效；對(duì)減弱的胃腸功能有促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，排除腹中脹氣，從而有芳香健胃作用。其水提物和桂皮酸能促進(jìn)膽汁流量，具有明顯的利膽作用；其揮發(fā)油有較強(qiáng)的殺菌功效，對(duì)革蘭陽性菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)陰性菌的抑制作用[10]。故本文只選擇了桂皮醛作為四味清口含片質(zhì)量控制的指標(biāo)成分進(jìn)行定量研究，建立了四味清口含片中桂皮醛含量的測定方法。

3.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS（C18）（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇–φ=0.1%磷酸水溶液（35∶65，v/v）；檢測波長：290nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃。

3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取置干燥器（P2O5）中放置24h的桂皮醛對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇使完全溶解，制成0.2mg/mL的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液配成每1mL中含桂皮醛25μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

3.4 供試品溶液的制備

取本品10片，研細(xì)，過4號(hào)篩，取約0.3g，精密稱定。置棕色瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?50W，頻率40kHz）20min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.5 缺桂心陰性對(duì)照溶液的制備

取處方中除桂心外的其他藥材，按處方劑量及制法和工藝要求制備缺桂心陰性樣品，稱取0.3g，精密稱定。按“3.4”項(xiàng)下方法制備，即得。

3.6 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品、供試品、缺桂心陰性對(duì)照溶液各10μL，按“3.2”項(xiàng)條件進(jìn)樣。在該色譜條件下，桂皮醛與其他成分可達(dá)基線分離，桂皮醛保留時(shí)間約為14.4min，理論塔板數(shù)不低于3000，各成分分離度均大于1.5；陰性對(duì)照無干擾。見封三圖5。

3.7 方法學(xué)考察

3.7.1 線性范圍的考察 精密量取0.2mg/mL的桂皮醛對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋制成濃度為1.000μg/mL、2.000μg/mL、5.000μg/mL、10.000μg/mL、25.000μg/mL、50.000μg/mL的系列對(duì)照品溶液，搖勻。在“3.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣10μL，記錄各色譜峰峰面積，峰面積測定結(jié)果見表1；以桂皮醛峰面積均值（Y）為縱坐標(biāo)、桂皮醛進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=11582X+2.3188，r=0.9999。結(jié)果顯示，桂皮醛進(jìn)樣量在0.010～0.500μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

3.7.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取桂皮醛對(duì)照品溶液10μL，在“3.2”項(xiàng)條件下平行測定6次，記錄桂皮醛的峰面積，平均峰面積為2899.82，其RSD為1.03%，表明儀器精密度良好。

3.7.3 檢測限及定量限的測定 精密稱取桂皮醛對(duì)照品15.86mg，加甲醇使溶解并稀釋制成濃度分別為0.01586、0.03172、0.04758、0.06344μg/mL的系列桂皮醛溶液，分別精密吸取10μL注入液相色譜儀，按S/N（信噪比）≥3來確定桂皮醛的檢測限；結(jié)果濃度為0.01586μg/mL的桂皮醛溶液進(jìn)樣10μL時(shí)，S/N>3。按S/N≥10來確定桂皮醛的定量限，結(jié)果濃度為0.06344μg/mL的桂皮醛溶液進(jìn)樣10μL時(shí)，S/N>10。故在本色譜條件下，桂皮醛的檢測限為0.01586μg/mL×10μL=0.16ng；其定量限為0.06344μg/mL×10μL=0.63ng。

3.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份對(duì)照品溶液及同一批號(hào)（20130501）供試品溶液，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、5、6.5、8、9、12h進(jìn)樣10μL，測定記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果對(duì)照品溶液的RSD為0.89%、供試品溶液的桂皮醛平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.2760mg/g，RSD為1.27%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液中的桂皮醛均能夠在12h內(nèi)保持穩(wěn)定。

3.7.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（20130501），共取6份、各約0.20g，精密稱定。按“3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件，測定峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果桂皮醛平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.2764mg/g，RSD為1.23%，表明重復(fù)性良好。endprint

3.7.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批號(hào)（20130501）四味清口含片（約相當(dāng)于桂皮醛3.2764mg/g）適量，研細(xì)，混勻，取約0.125g，精密稱定，平行取9份，分別置于25mL棕色量瓶中，再分別精密加入0.2mg/mL的桂皮醛對(duì)照品貯備液1.5，1.5，1.5，2，2，2，2.5，2.5，2.5mL，續(xù)加甲醇適量，超聲處理20min，取出，放置至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得加樣回收用供試品溶液；分別精密吸取10μL，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算桂皮醛回收率。結(jié)果見表2。

3.8 樣品含量測定

取3批中試樣品（20130501、20130510、20130520），分別按照“3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行操作3份。分別精密吸取各供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按“3.2”項(xiàng)下條件測定，計(jì)算桂皮醛含量。結(jié)果3批中試樣品中桂皮醛含量分別為1.6388、1.6409、1.6396mg/片。

4 討論

4.1 測定波長的選擇

取桂皮醛對(duì)照品溶液、四味清口含片供試品溶液和缺桂心陰性對(duì)照溶液適量，在200～350nm進(jìn)行掃描，結(jié)果對(duì)照品和供試品溶液在290nm波長處有最大吸收，而缺桂心陰性對(duì)照溶液在此無吸收，故選擇290nm為檢測波長。

4.2 提取方式的選擇

由于待測成分桂皮醛屬于易揮發(fā)性物質(zhì)，所以提取方式未考慮熱處理法（如回流提取、索氏提取等），文獻(xiàn)報(bào)道的提取方式也以超聲提取為主。試驗(yàn)中對(duì)提取時(shí)間（20min，30min，40min）、超聲波儀器的功率、是否過夜等不同影響因素進(jìn)行逐一考察，結(jié)果顯示：若超聲處理一次，則以20min為佳，原因是隨著超聲處理時(shí)間的延長，提取液溫度會(huì)有一定程度地升高，已提取出的桂皮醛會(huì)部分揮發(fā)逸失。超聲波儀器的功率對(duì)提取效率影響不大，功率高則提取效率稍高（約3.5%），《中國藥典》（2010年版）肉桂項(xiàng)下供試品溶液的制備采用“超聲-放置過夜-超聲”的處理方式，本次試驗(yàn)也將該方法的提取效果與直接超聲提取一次進(jìn)行比較，結(jié)果“超聲-過夜–超聲”方式的提取效率只相當(dāng)于直接超聲提取一次的88%。藥典方法測定肉桂中的桂皮醛，放置過夜的目的是為了使溶劑充分滲入藥材的組織細(xì)胞內(nèi)部而使桂皮醛充分溶出；而四味清口含片中的桂皮醛則存在于揮發(fā)油的β-環(huán)糊精包合物中，超聲（功率250W，頻率40kHz）20min足以使其完全溶出，放置過夜反而會(huì)導(dǎo)致桂皮醛逸失而使測定結(jié)果偏低。綜合上述因素，選擇超聲處理20min提取桂皮醛。

4.3 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同的流動(dòng)相，乙腈–水[11-12]、甲醇-水[13-14]和乙腈–φ=0.1%磷酸水溶液[15-16]，結(jié)果以乙腈–φ=0.1%磷酸水溶液分離效果較好，但考慮到乙腈的毒性較大，且價(jià)格較貴，選用甲醇代替，結(jié)果分離效果不受影響，同時(shí)考察了不同比例的甲醇和φ=0.1%磷酸水溶液，結(jié)果甲醇–φ=0.1%磷酸水溶液（35∶65，v/v）效果最好。

4.4 桂皮醛的使用操作

桂皮醛對(duì)光線敏感[17]，在試驗(yàn)過程中采用棕色量瓶配制溶液并存放在陰涼處避光，快速操作。

本文所建立的桂心、甘草、細(xì)辛、廣陳皮TLC法均具有良好的專屬性和重現(xiàn)性，可用于四味清口含片的藥材定性鑒別；所建立的含量測定方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，專屬性好，可用于四味清口含片中桂皮醛的含量測定，能客觀地控制和評(píng)價(jià)四味清口含片的質(zhì)量。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 揚(yáng)金生，趙美麗.華佗神方[M]. 北京：中醫(yī)古籍出版社，2002：119.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部） [S].北京：中國醫(yī)藥科學(xué)出版社，2010：176.

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[4] Kaur G，Tirkey N，Chopra K.Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity [J].Toxicology，2006，226（2-3）：152-160.

[5] 蔡葵花，文劍明，袁顯忠，等.新會(huì)柑皮中抗白血病主要成分的鑒定[J].分析化學(xué)， 1997， 52（ 11）： 1270-1273.

[6] Morley K，F(xiàn)erguson P，Koropatnick J.Tangeretin and nobiletin induce G1 cell cycle arrest but not apoptosis in human breast and colon cancer cells[J].Cancer Letters，2007，251（1）：168-178.

[7] Whitman SC，Kurowska EM，Manthey JA，et al.Nobiletin， a citrus flavonoid isolated from tangerines， selectively inhibits classA scavenger receptor-mediated metabolism off acetylated LDL by mouse、macrophages[J].Atherosclerosis， 2005，178（1）：25-32.

[8] Kurowska E M，M anthey JA.Hypolipidemic effects and absorption of citrus polymethoxylated flavones in hamsters with diet- Induced hypercholesterolemia[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004，52（10）：2879-2886.

[9] 鄭國棟.嶺南特色藥材廣陳皮化學(xué)成分及其質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].廣州：中山大學(xué)，2009：54-58.

[10] 江蘇中醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典上冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985：891.

[11] 賈曉斌，王麗靜，陳彥，等.HPLC測定肉桂、木香中桂皮醛、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯[J].中成藥，2010，32（3）：459-462.

[12] 劉光斌，毛和平，姜芳寧，等.HPLC法測定和胃散中桂皮醛的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（7）：67-68.

[13] 鐘鏡金，楊仙芳.HPLC法測定桂附地黃丸中桂皮醛的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（2）：415-416.

[14] 周平蘭，張婷.HPLC法測定哮喘貼敷散中桂皮醛的含量[J].中國藥師，2010，13（11）：1672-1673.

[15] 王偉影，范蕾，劉斌.HPLC法測定附桂骨痛顆粒中桂皮醛含量[J].中國藥師，2011，14（4）：575-576.

[16] 宋利輝，張蓉，萬紅菊，等.HPLC法測定桂枝茯苓片中桂皮醛的含量[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，12（2）：39-41.

[17] 馬蓉蓉，唐意紅，孫兆林，等.RP–HPLC測定不同產(chǎn)地肉桂中桂皮醛和肉桂酸的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，10（4）：9-11.

（收稿日期：2014-06-10）endprint

3.7.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批號(hào)（20130501）四味清口含片（約相當(dāng)于桂皮醛3.2764mg/g）適量，研細(xì)，混勻，取約0.125g，精密稱定，平行取9份，分別置于25mL棕色量瓶中，再分別精密加入0.2mg/mL的桂皮醛對(duì)照品貯備液1.5，1.5，1.5，2，2，2，2.5，2.5，2.5mL，續(xù)加甲醇適量，超聲處理20min，取出，放置至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得加樣回收用供試品溶液；分別精密吸取10μL，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算桂皮醛回收率。結(jié)果見表2。

3.8 樣品含量測定

取3批中試樣品（20130501、20130510、20130520），分別按照“3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行操作3份。分別精密吸取各供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按“3.2”項(xiàng)下條件測定，計(jì)算桂皮醛含量。結(jié)果3批中試樣品中桂皮醛含量分別為1.6388、1.6409、1.6396mg/片。

4 討論

4.1 測定波長的選擇

取桂皮醛對(duì)照品溶液、四味清口含片供試品溶液和缺桂心陰性對(duì)照溶液適量，在200～350nm進(jìn)行掃描，結(jié)果對(duì)照品和供試品溶液在290nm波長處有最大吸收，而缺桂心陰性對(duì)照溶液在此無吸收，故選擇290nm為檢測波長。

4.2 提取方式的選擇

由于待測成分桂皮醛屬于易揮發(fā)性物質(zhì)，所以提取方式未考慮熱處理法（如回流提取、索氏提取等），文獻(xiàn)報(bào)道的提取方式也以超聲提取為主。試驗(yàn)中對(duì)提取時(shí)間（20min，30min，40min）、超聲波儀器的功率、是否過夜等不同影響因素進(jìn)行逐一考察，結(jié)果顯示：若超聲處理一次，則以20min為佳，原因是隨著超聲處理時(shí)間的延長，提取液溫度會(huì)有一定程度地升高，已提取出的桂皮醛會(huì)部分揮發(fā)逸失。超聲波儀器的功率對(duì)提取效率影響不大，功率高則提取效率稍高（約3.5%），《中國藥典》（2010年版）肉桂項(xiàng)下供試品溶液的制備采用“超聲-放置過夜-超聲”的處理方式，本次試驗(yàn)也將該方法的提取效果與直接超聲提取一次進(jìn)行比較，結(jié)果“超聲-過夜–超聲”方式的提取效率只相當(dāng)于直接超聲提取一次的88%。藥典方法測定肉桂中的桂皮醛，放置過夜的目的是為了使溶劑充分滲入藥材的組織細(xì)胞內(nèi)部而使桂皮醛充分溶出；而四味清口含片中的桂皮醛則存在于揮發(fā)油的β-環(huán)糊精包合物中，超聲（功率250W，頻率40kHz）20min足以使其完全溶出，放置過夜反而會(huì)導(dǎo)致桂皮醛逸失而使測定結(jié)果偏低。綜合上述因素，選擇超聲處理20min提取桂皮醛。

4.3 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同的流動(dòng)相，乙腈–水[11-12]、甲醇-水[13-14]和乙腈–φ=0.1%磷酸水溶液[15-16]，結(jié)果以乙腈–φ=0.1%磷酸水溶液分離效果較好，但考慮到乙腈的毒性較大，且價(jià)格較貴，選用甲醇代替，結(jié)果分離效果不受影響，同時(shí)考察了不同比例的甲醇和φ=0.1%磷酸水溶液，結(jié)果甲醇–φ=0.1%磷酸水溶液（35∶65，v/v）效果最好。

4.4 桂皮醛的使用操作

桂皮醛對(duì)光線敏感[17]，在試驗(yàn)過程中采用棕色量瓶配制溶液并存放在陰涼處避光，快速操作。

本文所建立的桂心、甘草、細(xì)辛、廣陳皮TLC法均具有良好的專屬性和重現(xiàn)性，可用于四味清口含片的藥材定性鑒別；所建立的含量測定方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，專屬性好，可用于四味清口含片中桂皮醛的含量測定，能客觀地控制和評(píng)價(jià)四味清口含片的質(zhì)量。

[參考文獻(xiàn)]

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[3] Yeh CC，K ao SJ，Lin CC，et al.The immunomodulation of endotox in- induced acute lung in jury by hesperidin in vivo and in vitro[J].Life Sciences，2007，80（20）：1821-1831.

[4] Kaur G，Tirkey N，Chopra K.Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity [J].Toxicology，2006，226（2-3）：152-160.

[5] 蔡葵花，文劍明，袁顯忠，等.新會(huì)柑皮中抗白血病主要成分的鑒定[J].分析化學(xué)， 1997， 52（ 11）： 1270-1273.

[6] Morley K，F(xiàn)erguson P，Koropatnick J.Tangeretin and nobiletin induce G1 cell cycle arrest but not apoptosis in human breast and colon cancer cells[J].Cancer Letters，2007，251（1）：168-178.

[7] Whitman SC，Kurowska EM，Manthey JA，et al.Nobiletin， a citrus flavonoid isolated from tangerines， selectively inhibits classA scavenger receptor-mediated metabolism off acetylated LDL by mouse、macrophages[J].Atherosclerosis， 2005，178（1）：25-32.

[8] Kurowska E M，M anthey JA.Hypolipidemic effects and absorption of citrus polymethoxylated flavones in hamsters with diet- Induced hypercholesterolemia[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004，52（10）：2879-2886.

[9] 鄭國棟.嶺南特色藥材廣陳皮化學(xué)成分及其質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].廣州：中山大學(xué)，2009：54-58.

[10] 江蘇中醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典上冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1985：891.

[11] 賈曉斌，王麗靜，陳彥，等.HPLC測定肉桂、木香中桂皮醛、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯[J].中成藥，2010，32（3）：459-462.

[12] 劉光斌，毛和平，姜芳寧，等.HPLC法測定和胃散中桂皮醛的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（7）：67-68.

[13] 鐘鏡金，楊仙芳.HPLC法測定桂附地黃丸中桂皮醛的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（2）：415-416.

[14] 周平蘭，張婷.HPLC法測定哮喘貼敷散中桂皮醛的含量[J].中國藥師，2010，13（11）：1672-1673.

[15] 王偉影，范蕾，劉斌.HPLC法測定附桂骨痛顆粒中桂皮醛含量[J].中國藥師，2011，14（4）：575-576.

[16] 宋利輝，張蓉，萬紅菊，等.HPLC法測定桂枝茯苓片中桂皮醛的含量[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，12（2）：39-41.

[17] 馬蓉蓉，唐意紅，孫兆林，等.RP–HPLC測定不同產(chǎn)地肉桂中桂皮醛和肉桂酸的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，10（4）：9-11.

（收稿日期：2014-06-10）endprint

3.7.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批號(hào)（20130501）四味清口含片（約相當(dāng)于桂皮醛3.2764mg/g）適量，研細(xì)，混勻，取約0.125g，精密稱定，平行取9份，分別置于25mL棕色量瓶中，再分別精密加入0.2mg/mL的桂皮醛對(duì)照品貯備液1.5，1.5，1.5，2，2，2，2.5，2.5，2.5mL，續(xù)加甲醇適量，超聲處理20min，取出，放置至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得加樣回收用供試品溶液；分別精密吸取10μL，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算桂皮醛回收率。結(jié)果見表2。

3.8 樣品含量測定

取3批中試樣品（20130501、20130510、20130520），分別按照“3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行操作3份。分別精密吸取各供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按“3.2”項(xiàng)下條件測定，計(jì)算桂皮醛含量。結(jié)果3批中試樣品中桂皮醛含量分別為1.6388、1.6409、1.6396mg/片。

4 討論

4.1 測定波長的選擇

取桂皮醛對(duì)照品溶液、四味清口含片供試品溶液和缺桂心陰性對(duì)照溶液適量，在200～350nm進(jìn)行掃描，結(jié)果對(duì)照品和供試品溶液在290nm波長處有最大吸收，而缺桂心陰性對(duì)照溶液在此無吸收，故選擇290nm為檢測波長。

4.2 提取方式的選擇

由于待測成分桂皮醛屬于易揮發(fā)性物質(zhì)，所以提取方式未考慮熱處理法（如回流提取、索氏提取等），文獻(xiàn)報(bào)道的提取方式也以超聲提取為主。試驗(yàn)中對(duì)提取時(shí)間（20min，30min，40min）、超聲波儀器的功率、是否過夜等不同影響因素進(jìn)行逐一考察，結(jié)果顯示：若超聲處理一次，則以20min為佳，原因是隨著超聲處理時(shí)間的延長，提取液溫度會(huì)有一定程度地升高，已提取出的桂皮醛會(huì)部分揮發(fā)逸失。超聲波儀器的功率對(duì)提取效率影響不大，功率高則提取效率稍高（約3.5%），《中國藥典》（2010年版）肉桂項(xiàng)下供試品溶液的制備采用“超聲-放置過夜-超聲”的處理方式，本次試驗(yàn)也將該方法的提取效果與直接超聲提取一次進(jìn)行比較，結(jié)果“超聲-過夜–超聲”方式的提取效率只相當(dāng)于直接超聲提取一次的88%。藥典方法測定肉桂中的桂皮醛，放置過夜的目的是為了使溶劑充分滲入藥材的組織細(xì)胞內(nèi)部而使桂皮醛充分溶出；而四味清口含片中的桂皮醛則存在于揮發(fā)油的β-環(huán)糊精包合物中，超聲（功率250W，頻率40kHz）20min足以使其完全溶出，放置過夜反而會(huì)導(dǎo)致桂皮醛逸失而使測定結(jié)果偏低。綜合上述因素，選擇超聲處理20min提取桂皮醛。

4.3 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同的流動(dòng)相，乙腈–水[11-12]、甲醇-水[13-14]和乙腈–φ=0.1%磷酸水溶液[15-16]，結(jié)果以乙腈–φ=0.1%磷酸水溶液分離效果較好，但考慮到乙腈的毒性較大，且價(jià)格較貴，選用甲醇代替，結(jié)果分離效果不受影響，同時(shí)考察了不同比例的甲醇和φ=0.1%磷酸水溶液，結(jié)果甲醇–φ=0.1%磷酸水溶液（35∶65，v/v）效果最好。

4.4 桂皮醛的使用操作

桂皮醛對(duì)光線敏感[17]，在試驗(yàn)過程中采用棕色量瓶配制溶液并存放在陰涼處避光，快速操作。

本文所建立的桂心、甘草、細(xì)辛、廣陳皮TLC法均具有良好的專屬性和重現(xiàn)性，可用于四味清口含片的藥材定性鑒別；所建立的含量測定方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，專屬性好，可用于四味清口含片中桂皮醛的含量測定，能客觀地控制和評(píng)價(jià)四味清口含片的質(zhì)量。

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[3] Yeh CC，K ao SJ，Lin CC，et al.The immunomodulation of endotox in- induced acute lung in jury by hesperidin in vivo and in vitro[J].Life Sciences，2007，80（20）：1821-1831.

[4] Kaur G，Tirkey N，Chopra K.Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity [J].Toxicology，2006，226（2-3）：152-160.

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[6] Morley K，F(xiàn)erguson P，Koropatnick J.Tangeretin and nobiletin induce G1 cell cycle arrest but not apoptosis in human breast and colon cancer cells[J].Cancer Letters，2007，251（1）：168-178.

[7] Whitman SC，Kurowska EM，Manthey JA，et al.Nobiletin， a citrus flavonoid isolated from tangerines， selectively inhibits classA scavenger receptor-mediated metabolism off acetylated LDL by mouse、macrophages[J].Atherosclerosis， 2005，178（1）：25-32.

[8] Kurowska E M，M anthey JA.Hypolipidemic effects and absorption of citrus polymethoxylated flavones in hamsters with diet- Induced hypercholesterolemia[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004，52（10）：2879-2886.

[9] 鄭國棟.嶺南特色藥材廣陳皮化學(xué)成分及其質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].廣州：中山大學(xué)，2009：54-58.

[10] 江蘇中醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典上冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1985：891.

[11] 賈曉斌，王麗靜，陳彥，等.HPLC測定肉桂、木香中桂皮醛、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯[J].中成藥，2010，32（3）：459-462.

[12] 劉光斌，毛和平，姜芳寧，等.HPLC法測定和胃散中桂皮醛的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（7）：67-68.

[13] 鐘鏡金，楊仙芳.HPLC法測定桂附地黃丸中桂皮醛的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（2）：415-416.

[14] 周平蘭，張婷.HPLC法測定哮喘貼敷散中桂皮醛的含量[J].中國藥師，2010，13（11）：1672-1673.

[15] 王偉影，范蕾，劉斌.HPLC法測定附桂骨痛顆粒中桂皮醛含量[J].中國藥師，2011，14（4）：575-576.

[16] 宋利輝，張蓉，萬紅菊，等.HPLC法測定桂枝茯苓片中桂皮醛的含量[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，12（2）：39-41.

[17] 馬蓉蓉，唐意紅，孫兆林，等.RP–HPLC測定不同產(chǎn)地肉桂中桂皮醛和肉桂酸的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，10（4）：9-11.

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