劉 偉，馬云勝，穆長(zhǎng)征，田 鶴

（遼寧醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州121000）

腎臟損傷后可以再生，原因是由于在腎臟組織中存在一部分再生能力較強(qiáng)，具有一定自我更新能力的干細(xì)胞樣細(xì)胞成分。從目前的研究結(jié)果看，由于腎臟中細(xì)胞成分復(fù)雜，腎臟中有可能存在幾種干／祖細(xì)胞，因此其標(biāo)志物亦可能根據(jù)不同的節(jié)段而不同。Bussolati等［1］發(fā)現(xiàn)從人腎臟中分離培養(yǎng)的CD133細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，也可以分化為上皮或內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)小管損傷，因此這群細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。本研究在小鼠腎臟原位檢測(cè)CD133細(xì)胞的表達(dá)與分布，從空間定位角度分析該細(xì)胞的位置及數(shù)量，為該細(xì)胞組織修復(fù)提供數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選取昆明小鼠12只（遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，雌雄不限，35～30g，3月齡）；兔抗CD133（北京博奧森公司），DAB（武漢博士德公司）；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司）。

1.2 方法

1.2.1 腎臟組織的采集 取成熟健康昆明小鼠，左心室灌流固定后，取雙側(cè)腎臟，4%多聚甲醛固定24h后，梯度乙醇脫水，入二甲苯透明，60℃浸蠟3h，包埋制成石蠟塊。

1.2.2 切片制備與CD133免疫組織化學(xué)檢測(cè) 用Leca3215切片機(jī)將腎臟組織切成5μm厚度切片，黏附于涂有多聚賴(lài)氨酸的防脫片上，60℃烤片2h后，切片二甲苯脫蠟2h，梯度乙醇下行入水。3%過(guò)氧化氫清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶5min，枸櫞酸鹽緩沖液高壓鍋法進(jìn)行抗原修復(fù)。自然冷卻后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5min，組畫(huà)筆畫(huà)圈，5%BSA封閉10min室溫下滴加兔抗CD133（1∶200）抗體。濕盒內(nèi)4℃冰箱過(guò)夜。次日取出去除一抗，PBS洗3次，滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育1h，PBS洗3次，DAB顯色并觀(guān)察，適時(shí)終止顯示，清水沖洗，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，樹(shù)膠封片。

1.2.3 免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)CD133表達(dá) 取整個(gè)腎臟，眼科剪剪碎，加1mL蛋白裂解液，超聲波使細(xì)胞充分裂解，然后分別轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，置于冰中30 min，然后4℃下12 000r／min離心40min，取總蛋白每孔30 μg，100 ℃ 煮 沸 10min，10% 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 （SPSPAGE）分離總蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PDVF）膜上，用5%脫脂奶粉封閉2h，一抗（兔抗CD133，1∶500）4℃孵育過(guò)夜，次日加二抗（1∶1 500）孵育2h，ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 Western blot結(jié)果采用系統(tǒng)自帶軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行光密度值的分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析比較樣本均數(shù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 CD133陽(yáng)性細(xì)胞分布于腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)（圖1）。在皮質(zhì)區(qū)域，CD133表達(dá)于一小部分遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞的頂端（圖1a），散在分布，注意CD133都表達(dá)在靠近腎小體血管極的遠(yuǎn)端小管曲部上。偶爾在細(xì)胞質(zhì)里也可見(jiàn)到陽(yáng)性表達(dá)（圖1b）。甚至有少量CD133細(xì)胞表達(dá)在小管上皮細(xì)胞的側(cè)面和整個(gè)小管的周?chē)?。在髓質(zhì)和腎乳頭區(qū)域CD133表達(dá)于升支粗段，細(xì)段和集合管（圖1c）。在內(nèi)髓CD133分布的較外髓內(nèi)帶要廣泛，并且以一小群細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞表達(dá)形式存在（圖1d～f）。

圖1 小鼠腎臟中CD133的免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果 Western blot檢測(cè)提示小鼠腎臟組織中均檢測(cè)到CD133表達(dá)，在120×103左右出現(xiàn)特異性結(jié)合條帶，見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠腎臟組織CD133Western blot結(jié)果

3 討 論

腎臟中組織成分復(fù)雜，其損失后修復(fù)的機(jī)制可能有多種。腎小管上皮細(xì)胞具有一定的更新能力，這說(shuō)明腎小管上皮必然存在具有干細(xì)胞屬性的細(xì)胞成分。而在很多疾病導(dǎo)致的腎臟小管上皮細(xì)胞壞死等都依賴(lài)于腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)和再生，以重新恢復(fù)其營(yíng)養(yǎng)重新收及水代謝功能。CD133被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物，在某些腫瘤如腎透明細(xì)胞癌中呈大量陽(yáng)性表達(dá)。CD133也可以被認(rèn)為是一群干／祖細(xì)胞標(biāo)志物，CD133抗原早期用于從造血組織和神經(jīng)組織中分離干細(xì)胞，在造血組織中CD133只表達(dá)于CD34陽(yáng)性干細(xì)胞和祖細(xì)胞上［2］。此外，在骨骼肌和神經(jīng)組織中也存在一部分CD133陽(yáng)性細(xì)胞［3］。Osafune等［4］從腎臟細(xì)胞中分離的CD133細(xì)胞不表達(dá)CD34和CD45，這說(shuō)明在不同的組織中表達(dá)CD133細(xì)胞是不同的。Bruno等［5］在體外研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞具有自我更新和復(fù)制的能力。此外從形態(tài)上看CD133細(xì)胞具有明顯的極性，這說(shuō)明他們具有分化細(xì)胞的特征。體外研究表明，CD133細(xì)胞具有較強(qiáng)的擴(kuò)增能力，標(biāo)記后的CD133細(xì)胞靜脈注射到SCID小鼠后，該細(xì)胞在腎小管并修復(fù)了腎小管損傷，從而修復(fù)腎臟損傷［6－7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠的腎臟內(nèi)髓，腎乳頭區(qū)集合管，細(xì)段，廣泛分布著CD133陽(yáng)性細(xì)胞。而在皮質(zhì)和外髓區(qū)CD133陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量較少，僅限于髓放線(xiàn)集合管和腎單位區(qū)髓袢升支細(xì)段和遠(yuǎn)曲小管，皮質(zhì)集合管則沒(méi)有分布。Lazzeri等［8］應(yīng)用Brud標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)腎乳頭區(qū)細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，表現(xiàn)為大量的標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)，并認(rèn)為該區(qū)為腎臟干細(xì)胞的定居點(diǎn)［8］，本研究發(fā)現(xiàn)，CD133分布在內(nèi)髓腎乳頭區(qū)較多，少量分布于外髓的集合管和腎單位遠(yuǎn)端小管。作者的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步印證了O′N(xiāo)eill等［9］的觀(guān)點(diǎn)，該觀(guān)察可以為對(duì)于腎臟損傷修復(fù)的細(xì)胞分布的空間位置關(guān)系提供形態(tài)學(xué)依據(jù)，同時(shí)本研究也可能解釋遠(yuǎn)端小管修復(fù)機(jī)制，下一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)該研究在腎臟損傷疾病模型上CD133的表達(dá)情況，進(jìn)一步揭示腎臟損傷及修復(fù)的機(jī)制。總之，腎臟中干細(xì)胞表達(dá)CD133，本實(shí)驗(yàn)從原位尋找CD133表達(dá)位置，為腎臟干細(xì)胞提供空間表達(dá)數(shù)據(jù)。

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