李 建，李春輝，秦博文，呂瑞芳

（1.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院護(hù)理系，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北承德 067000）

我國胃癌的發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第2位，研究提示細(xì)胞周期調(diào)控在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因此，探討胃癌細(xì)胞周期調(diào)控的作用機(jī)制對臨床胃癌的診治與預(yù)防具有重要意義。目前有關(guān)TGF－β1、Smad2、CyclinD1三者在胃癌中表達(dá)的研究較少，本研究通過免疫組織化學(xué)的方法檢測胃癌組織中TGF－β1、Smad2、CyclinD1蛋白的表達(dá)狀況，探討三者與胃癌臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系，為后續(xù)研究胃癌的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2007年1月至2012年1月腔鏡活檢正常胃黏膜20例為對照組，手術(shù)切除胃癌標(biāo)本60例為試驗(yàn)組。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 標(biāo)本切除后均立即浸入10%中性甲醛固定液中，取大小2cm×2cm、厚3mm的組織塊，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚4μm。放至70℃熱水中展平，再撈至載玻片的一端，置80℃恒溫箱中烘干。

1.2.2 脫蠟染色，切片置于85%乙醇20s、90%乙醇30s、95%乙醇Ⅰ中1min、95%乙醇Ⅱ中1min、無水乙醇Ⅰ中2 min、無水乙醇Ⅱ中2min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各1min，封固。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判定 在光學(xué)顯微鏡下觀察正常胃黏膜及胃癌標(biāo)本的免疫組化染色結(jié)果、定位及初步分析判斷。應(yīng)用CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍（×400）視野，分別對5個(gè)不同視野中的各組免疫組化結(jié)果進(jìn)行積分光密度（IOD）測定，然后計(jì)算平均IOD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用x±s表示。兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較用方差分析。并將各因子IOD進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

TGF－β1蛋白在試驗(yàn)組和對照組中表達(dá)的IOD分別為12.25±5.12和8.13±2.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Smad2蛋白表達(dá)的IOD分別為6.42±2.13和13.31±3.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CyclinD1蛋白表達(dá)的IOD分別為16.02±4.32、9.45±2.29，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

TGF－β1、Smad2、CyclinD1 蛋白表達(dá)與年齡、性別無關(guān)（P＞0.05）；在分化程度、有無淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 TGF－β1、Smad2和CyclinD1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

表1 TGF－β1、Smad2和CyclinD1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

項(xiàng)目 n clinD1年齡（歲）IOD TGF－β1 Smad2 Cy≥60 28 16.41±4.20 15.51±1.37 14.41±3.10＜60 32 17.14±3.27 13.21±1.83 14.01±4.35

續(xù)表1 TGF－β1、Smad2和CyclinD1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系s）

續(xù)表1 TGF－β1、Smad2和CyclinD1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系s）

項(xiàng)目 n IOD TGF－β1 Smad2 CyclinD1 37 17.26±4.23 16.02±3.41 15.34±3.32女23 18.24±2.83 15.65±3.21 14.51±2.11分化程度高中分化 28 10.62±2.35 16.12±2.32 13.41±1.81低分化 32 13.24±3.81 12.52±1.57 15.17±2.36淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無27 10.34±6.53 16.52±2.13 13.32±3.54有33 14.51±2.34 9.35±2.24 17.52±3.42 TNM分期Ⅰ＋Ⅱ 29 16.01±5.33 19.23±4.12 16.10±3.01Ⅲ＋Ⅳ性別男31 22.24±4.42 13.13±3.07 22.21±3.24

3 討 論

TGF－β1對正常細(xì)胞及早期的腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等來調(diào)控對它們的抑制作用，而在進(jìn)展期腫瘤的過程中則促進(jìn)細(xì)胞增殖進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等［1］。TGF－β是一種重要的細(xì)胞因子，具有抑制細(xì)胞分裂和增殖的作用。有研究表明，腫瘤的發(fā)生和惡性細(xì)胞對TGF－β產(chǎn)生抵抗作用關(guān)系密切，當(dāng)TGF－β信號(hào)通路改變，其對靶細(xì)胞失去效應(yīng)，甚至可促進(jìn)腫瘤的演進(jìn)［2－3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TGF－β1在正常胃黏膜中正常表達(dá)或弱表達(dá)，在胃癌中表達(dá)上調(diào)，且隨著胃腫瘤細(xì)胞分化降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期增高而表達(dá)加強(qiáng)，但是與患者的年齡以及性別無關(guān)，該結(jié)果與Naef等［4］的報(bào)道基本一致。

在腫瘤細(xì)胞中，大多數(shù)的錯(cuò)義突變位于MH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)，Smad2通過錯(cuò)義突變、移碼突變等基因位點(diǎn)的改變導(dǎo)致失活，腫瘤的錯(cuò)義突變使得Smads蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)上的氨基酸發(fā)生互換，這樣一些同源或異源復(fù)合物形成必然受阻，而R2Smads依賴受體的磷酸化作用發(fā)生障礙，或形成不穩(wěn)定的Smads蛋白［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Smad2蛋白在正常胃黏膜中IOD很高，在腫瘤發(fā)展的過程中，臨床病理特征上表現(xiàn)為低分化者Smad2蛋白的IOD值偏小，而高中分化者Smad2蛋白的IOD值比低分化者高很多，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中，Smad2蛋白的IOD值低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，TNM分期Ⅲ＋Ⅳ期的Smad2蛋白的IOD值低于TNM分期Ⅰ＋Ⅱ期。從以上結(jié)果中不難看出隨著胃癌的進(jìn)展、惡化，Smad2的表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢，該結(jié)果與上述的研究結(jié)論基本一致。

CyclinDl基因是一種非顯性致癌基因，許多學(xué)者認(rèn)為，在細(xì)胞生長周期進(jìn)程中，CyclinD1的水平受生長因子等許多因素的調(diào)控，呈周期性變化［6］。在 G1期CyclinD1與CDK4或CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，隨后通過N末端的LECXE基序與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb）編碼蛋白pRb結(jié)合，使pRb的Ser和Tyr殘基發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)錄因子E2F被釋放進(jìn)而活化后，細(xì)胞周期就會(huì)由G1期進(jìn)入S期，細(xì)胞增殖旺盛，如果CyclinD1表達(dá)失控，細(xì)胞增殖周期將會(huì)失調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［7－8］。目前對胃癌的發(fā)生、發(fā)展與CyclinDl關(guān)系的研究并不明確，CyclinDl表達(dá)異常引起的細(xì)胞周期失控是細(xì)胞異常增殖和癌變的原因，可能是胃癌發(fā)生的早期分子事件［9］。Stelow等［10］發(fā)現(xiàn)胃癌中CyclinDl的表達(dá)率與患者的性別、年齡及胃癌臨床病理學(xué)指標(biāo)如分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分期及腫瘤大小均無相關(guān)性，認(rèn)為CyclinDl在早期胃癌中的表達(dá)起到重要的作用，可以作為一個(gè)潛在的早期腫瘤標(biāo)記，對腫瘤預(yù)后的判斷無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在胃癌中的表達(dá)明顯高于正常胃黏膜，低分化胃癌的表達(dá)高于高中分化胃癌，而且在分化程度越低的癌腫表達(dá)率越高，該研究結(jié)果同樣支持CyclinD1與胃癌的分化程度、侵及深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)為探討胃癌的發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的思路，為TGF－β1、Smad2、CyclinD1成為靶向藥物作用的潛在靶點(diǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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