羅大衛(wèi)，鄒海東，劉 堃，鄭 志，孫曉東，許 迅，朱弼珺

（上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院眼科 200080）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是成年人低視力和盲的主要原因［1］。DR發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，且無有效的治愈方法，早期發(fā)現(xiàn)、早期治療對(duì)延緩其進(jìn)展至關(guān)重要［2］。一氧化氮（NO）作為一種重要的血管活性物質(zhì)，與DR中毛細(xì)血管閉塞、微循環(huán)障礙、內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)［3］。一氧化氮合成酶（NOS）是NO合成過程中的關(guān)鍵酶，可直觀反映NO在DR中的作用機(jī)制［4］。氨基胍是一類NOS抑制劑，可以抑制NOS的活性，對(duì)DR等具有一定的治療效果［5］，但是其作用途徑及機(jī)制尚不明確，因此，研究氨基胍治療DR的機(jī)制可以指導(dǎo)臨床用藥，對(duì)開發(fā)新的治療藥物具有一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性 Wistar大鼠共60只，體質(zhì)量180～200g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK（皖）2012004。在普通環(huán)境下（通風(fēng)，溫度18～23℃，濕度50%～60%）飼養(yǎng)，自由飲水。（2）實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：氨基胍（AG，Sigma）；胰激肽原酶（常州千紅生化制藥）；鏈脲佐菌素（STZ，Alexi）；DMEM，誘導(dǎo)型 NOS（iNOS）、內(nèi)皮細(xì)胞型NOS（eNOS）、神經(jīng)型 NOS（nNOS）ELISA試劑盒購(gòu)自碧云天；蛋白質(zhì)提取試劑盒（碧云天），iNOS、eNOS、nNOS抗體，羊抗鼠二抗，鼠β－actin抗體購(gòu)自北京中杉金橋，手術(shù)器材，CO2培養(yǎng)箱，光學(xué)顯微鏡，酶標(biāo)儀，紫外分光光度計(jì)，離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 將60只大鼠分為糖尿病組、氨基胍治療組和對(duì)照組，每組20只。氨基胍治療組和糖尿病組大鼠使用STZ制造糖尿病模型。按50mg／kg稱取STZ溶于pH為4.4的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液，對(duì)禁食12h的大鼠進(jìn)行腹腔注射STZ造模，注射后24～48h取尾血測(cè)血糖。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：血糖大于16.65mmol／L，對(duì)照組20只僅腹腔注射等體積的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.2 給藥方法 氨基胍治療組大鼠每天灌胃給藥氨基胍100mg／kg，糖尿病組和對(duì)照組大鼠予等量的生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃給藥14d后，處死大鼠取出雙眼眼球，用生理鹽水清洗，一只放于4%多聚甲醛中固定過夜后存放于70%乙醇中，用于HE染色；另一只存放于－80℃冰箱中，用于 Western blot和PT－PCR檢測(cè)。血液在室溫下靜置0.5h后放于4℃冰箱中過夜，第2天離心后取出上清液存放于4℃冰箱中，用ELISA檢測(cè)。

1.2.3 HE染色 多聚甲醛固定過的眼球標(biāo)本用石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5μm，常規(guī)HE法染色。

1.2.4 ELISA檢測(cè)大鼠血清iNOS、eNOS、nNOS水平 大鼠血液靜置過夜后離心，取上清液，使用iNOS、eNOS、nNOS酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)血清中iNOS、eNOS、nNOS水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜中iNOS、eNOS、nNOS表達(dá)水平 將大鼠眼球組織塊取出，剪碎后用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取蛋白，18 000r／min離心1h，去上清液，固定后進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，然后使用SDS－PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到纖維膜，封閉。在漂洗后敷iNOS、eNOS、nNOS抗體（1∶500）和β－actin抗體（1∶300），TPBS漂洗后敷二抗（1∶5 000），ECL顯色，曝光。

1.2.6 PT－PCR測(cè)定iNOS、eNOS、nNOS mRNA表達(dá) 將眼球勻漿后，用Trizol法提取總RNA，然后取2μg RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。結(jié)果采用SDS軟件進(jìn)行2－ΔΔCT法相對(duì)定量分析。引物序列：eNOS上游引物5′－GGA GAG ATC CAC CTC ACT GTA GC－3′，下 游 引 物 5′－CAC ATA GGT CTT AGG G－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度421bp；nNOS上游引物5′－GTG GAG GTG CTG GAG GAG TTC－3′，下游引物5′－CGG ATT CAT TCC TTT GTG TTG－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度374bp；iNOS上游引物 5′－CAA TAA CCT GAA GCC CGA AGA C－3′，下游引物5′－GTA ATC CTC AAC CTG CTC CTC AC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 496bp；β－actin上游引物5′－CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA C－3′，下游引物5′－ACT CAT CGT ACT CCT GCT TGC T－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度227bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用x±s表示，多樣本均數(shù)比較采用 One－way ANOVA分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，多樣本組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠視網(wǎng)膜病理組織學(xué)HE染色比較 通過光學(xué)顯微鏡觀察HE染色的大鼠視網(wǎng)膜切片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠組織結(jié)構(gòu)清晰，完成，染色較為均勻，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列均勻。糖尿病組大鼠缺損最為明顯，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少。氨基胍治療組大鼠缺損不明顯，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞略少于正常大鼠。見圖1。

圖1 各組視網(wǎng)膜切片HE染色（×100）

2.2 3組大鼠血清中NOS水平比較 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基胍治療組、對(duì)照組iNOS水平顯著低于糖尿病組，對(duì)照組nNOS水平明顯低于其他兩組，3組eNOS水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。氨基胍治療組與糖尿病組比較，iNOS蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組大鼠血清中NOS水平比較s，n＝20，U／mgprot）

表1 3組大鼠血清中NOS水平比較s，n＝20，U／mgprot）

a：P＜0.05，與糖尿病組比較；b：P＜0.05，與對(duì)照組比較。

組別iNOS eNOS nNOS糖尿病組 0.393±0.092 0.263±0.051 0.313±0.031b氨基胍治療組 0.285±0.063a0.257±0.066 0.286±0.043b對(duì)照組0.276±0.076 0.249±0.058 0.216±0.074

2.3 3組大鼠NOS蛋白表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜中iNOS、eNOS、nNOS蛋白表達(dá)較低，糖尿病組較高。氨基胍治療組中iNOS的蛋白表達(dá)明顯弱于糖尿病組（P＝0.039），與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、3。

圖2 3組大鼠視網(wǎng)膜中NOS蛋白表達(dá)比較

圖3 3組大鼠血清中NOS蛋白表達(dá)比較

2.4 3組大鼠NOS mRNA表達(dá)比較 PT－PCR檢測(cè)顯示，氨基胍可以抑制iNOS mRNA的高表達(dá)，對(duì)eNOS mRNA和nNOS mRNA的高表達(dá)影響不明顯，見表2。

表2 各組大鼠NOS mRNA表達(dá)比較s，n＝20）

表2 各組大鼠NOS mRNA表達(dá)比較s，n＝20）

a：P＜0.05，與糖尿病組比較。

組別iNOS mRNA eNOS mRNA nNOS mRNA糖尿病組1.684±0.280 1.413±0.250 1.553±0.130氨基胍治療組 1.166±0.130a1.378±0.230 1.399±0.180對(duì)照組1.209±0.210 1.105±0.190 1.018±0.210

3 討 論

DR是一種多因素、多作用途徑的糖尿病并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類生命健康。DR的發(fā)生受到多種條件控制，例如視網(wǎng)膜新生血管，細(xì)胞凋亡等等［6］，早期糖尿病的研究主要集中在細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡與DR的發(fā)病有著密切的聯(lián)系［7］。研究發(fā)現(xiàn)，氨基胍會(huì)引起蛋白非酶糖基化終產(chǎn)物（AGEs）增加，AGEs可以通過使Bc－l2／Bax的比例降低以及caspase3的活化，從而引起毛細(xì)血管周細(xì)胞凋亡［7－8］。同時(shí)，氨基胍作為一種NOS抑制劑，對(duì)NOS具有顯著的抑制作用［8－9］，并有文獻(xiàn)報(bào)道，氨基胍對(duì)DR的治療作用與抑制NOS有關(guān)，但是其抑制作用是否具有NOS亞型選擇作用目前并不清楚，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)［9－10］。

DR都會(huì)引起視網(wǎng)膜細(xì)胞的缺損，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少［10－11］，降低視網(wǎng)膜細(xì)胞的缺損，增加神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量是治療視網(wǎng)膜病變的主要目的。本研究發(fā)現(xiàn)，使用氨基胍的大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞缺損情況減輕，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯增多。說明氨基胍可以抑制糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜病理性病變。

NOS分為iNOS、nNOS、eNOS 3個(gè)亞型［11－12］，它們?cè)隗w內(nèi)起到不同的作用。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中iNOS mRNA水平明顯提高，iNOS陽性細(xì)胞數(shù)也顯著增多，且陽性細(xì)胞主要分布在INL［13］。有研究表明，在正常大鼠視網(wǎng)膜中，iNOS免疫反應(yīng)沉淀物主要出現(xiàn)在INL的 Müller細(xì)胞中［12－15］，而此細(xì)胞是維系視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)的重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［16］。由此可推測(cè)iNOS產(chǎn)生的過多的NO有可能對(duì)血管造成損傷。因此，抑制iNOS的表達(dá)可能對(duì)治療DR具有一定的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，氨基胍對(duì)iNOS的水平及表達(dá)具有顯著的抑制作用，且具有選擇性。

本研究證實(shí)了氨基胍可以改善DR，且作用途徑與選擇性地抑制iNOS有關(guān)。對(duì)于氨基胍參與多作用途徑治療糖尿病微血管病變提供了試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)，為研究和開發(fā)新型的治療DR藥物起到一定的指導(dǎo)作用。

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