張志強 賀杰峰 張瑜 蘭志偉 趙浩亮

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma ，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第5位[1]。肝癌免疫治療是目前研究的熱點，但肝癌存在著嚴重的腫瘤免疫微環(huán)境抑制，從而影響了肝癌免疫治療的效果[2]。實驗動物肝癌模型的免疫微環(huán)境分析目前在國內(nèi)罕見報道，本研究通過建立誘導(dǎo)性大鼠肝癌模型，并分析肝癌局部免疫微環(huán)境中免疫細胞以及因子水平的變化及意義，為進一步改善肝癌免疫微環(huán)境、加強免疫治療的效果研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 Wistar雄性大鼠 40只，體重180～220g，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，在室內(nèi)標準規(guī)定條件下飼養(yǎng)，室溫20℃，每籠10只。二乙基亞硝胺（DEN）購自

美國Sigma公司。FITC-CD4單抗、PE-CD25單抗及同型對照FITC-IgG2b單抗、PE-IgG1單抗均購自美國BD公司。兔抗鼠IL-10、Treg多抗和SABC免疫組化試劑盒均購自北京博奧森公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分組 大鼠正常喂養(yǎng)1周后隨機分為三組：肝癌模型組（20只）、生理鹽水組（10只）、空白對照組（10只）。肝癌模型組：大鼠按100mg/kg給予DEN腹腔注射，1次/周。生理鹽水組（10只）：按腹腔注射同比例生理鹽水，1次/周?？瞻讓φ战M（10只）：大鼠不做任何處理。實驗期間正常飲食飲水。

1.2.2 流式細胞術(shù)(FCM)檢測 Treg的數(shù)量比例：分別制備大鼠肝癌模型組癌組織、生理鹽水組肝組織、空白對照組肝組織單個核細胞懸液 (1×107／ml)，取100μl細胞懸液，加入FITC-CD4單抗和 PE-CD25單抗，同時設(shè)同型抗體對照組(即加入等量的FITC-IgG2b單抗和PE-IgG1單抗)，以排除非特異性染色影響，避光放置20min。用FACSCalibur流式細胞儀檢測CD4、CD25的表達。

1.2.3 采用免疫組化SABC三步法檢測肝組織Treg和IL-10的表達 所有新鮮標本均經(jīng)10%甲醛固定，24 h內(nèi)取材，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚2μm。一抗工作濃度為1∶150，以PBS代替兩種一抗做陰性對照。枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)下微波修復(fù)抗原。其余步驟嚴格按說明書操作。Treg和 IL-10陽性細胞的著色主要表達在細胞漿和細胞膜。采用Mias-2000圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果:每張切片任意選取10個區(qū)域，在400倍物鏡下測定陽性物質(zhì)平均灰度值，灰度值與物質(zhì)表達水平成反比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0軟件處理分析，實驗數(shù)據(jù)用（）表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝癌模型的建立 肝癌模型組的16只Wistar大鼠成功建立肝癌模型（圖1為大鼠肝癌組織），實驗過程中大鼠的死亡率為20%。肝癌模型組實驗過程中大鼠毛發(fā)凌亂，無光澤，食欲差，精神萎靡，活動少，對外界刺激反應(yīng)慢。病理檢查顯示肝癌組大鼠誘導(dǎo)4周可見肝內(nèi)有假小葉形成，假小葉內(nèi)可見纖維再分隔現(xiàn)象。7周后癌變肝組織可見癌巢形成，癌細胞具有多形性和明顯異型性呈多角型，核大，核仁明顯，并可見多核巨細胞（圖2為肝癌癌細胞免疫組化染色）。

2.2 大鼠肝組織CD4+CD25+Treg百分率 肝癌模型組CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞百分率(14.32±4.84)%，較生理鹽水組(7.95±3.55)%和空白對照組(5.64±6.10)%顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 肝組織中Treg的比較（）

表1 肝組織中Treg的比較（）

注：與空白對照組比較，aP<0.05; 與生理鹽水組比較，bP<0.05

組別 例數(shù) CD4+CD25+Treg細胞（%）空白對照組 10 5.64±6.10生理鹽水組 10 7.95±3.55肝癌模型組 20 14.32±4.84ab

2.3 大鼠肝組織中Treg和IL-10水平 肝癌模型組癌組織中Treg和IL-10表達水平顯著高于空白對照組和生理鹽水組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)（圖3和圖4分別為Treg細胞和IL-10免疫組化染色），見表2。

表2 肝組織中Treg、IL-10表達水平（灰度值，）

表2 肝組織中Treg、IL-10表達水平（灰度值，）

注：與空白對照組比較，aP<0.05,bP<0.01;與生理鹽水組比較，cP<0.05,dP<0.05

組別 例數(shù) Treg IL-10空白對照組 10 150.6±1.6 168.8±3.5生理鹽水組 10 142.5±3.7c 157.6±4.3d肝癌模型組 20 118.4±2.4a 127.4±11.2b

2.4 Treg與IL-10的相關(guān)性分析 用SPSS軟件以Pearson相關(guān)分析法分析肝癌組織中Treg與IL-10表達水平的相關(guān)性，肝癌組織中Treg與IL-10表達水平變化的相關(guān)系數(shù)為0.567，P＜0.05。Treg與IL-10的表達水平呈明顯正相關(guān)。

3 討論

肝癌動物模型是研究肝癌發(fā)生發(fā)展機制和免疫治療的重要材料[3]。本研究對大鼠肝癌模型的制作進行了改進，通過比較發(fā)現(xiàn)建立的此肝癌模型微環(huán)境中Treg和IL-10水平變化趨勢與人類肝癌中的變化相似[4-5]，表明本研究建立的大鼠肝癌模型能夠模擬人類肝癌的免疫微環(huán)境，為下一步研究改善肝癌免疫微環(huán)境提供了合適的動物模型。

肝癌局部免疫微環(huán)境是由肝癌細胞和其周圍淋巴細胞、免疫細胞、腫瘤血管和淋巴管結(jié)構(gòu)的組成細胞等成分構(gòu)成，經(jīng)典的肝小葉結(jié)構(gòu)和這些細胞群以及它們釋放的物質(zhì)共同組成了肝臟的微環(huán)境[6]。肝癌微環(huán)境中的主要成分是一些免疫相關(guān)細胞和因子，它們貫穿于腫瘤發(fā)展的整個過程，對腫瘤產(chǎn)生了重大的影響[7]。Treg是一類具有免疫負性調(diào)控作用的免疫細胞，它對肝癌免疫微環(huán)境抑制和耐受起著關(guān)鍵作用[8]。研究表明，多種腫瘤患者的外周血和腫瘤局部的Treg增加，提示Treg在腫瘤微環(huán)境中能夠減弱免疫細胞功能，導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸，促使腫瘤進展[9]。但Treg在大鼠肝癌模型免疫微環(huán)境中的數(shù)量和功能尚未見報道。本研究顯示，大鼠肝癌組微環(huán)境中Treg較對照組明顯增加，提示大鼠機體免疫功能處于抑制狀態(tài)，從而能夠促進肝癌發(fā)生發(fā)展。IL-10主要由Th2細胞、單核細胞和腫瘤細胞產(chǎn)生，與TGF-β1共同作用通過抑制一氧化氮(NO)的產(chǎn)生而干擾IFN-r對巨噬細胞的活化[10]。本研究顯示肝癌組中IL-10較對照組明顯增加，可能是由于大鼠細胞免疫功能減弱，導(dǎo)致細胞因子調(diào)節(jié)紊亂，從而使微環(huán)境中IL-10水平升高。

Treg通過分泌IL-10等因子起免疫調(diào)節(jié)作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌微環(huán)境中Treg和IL-10表達水平明顯增加，而兩者的表達呈正相關(guān)，表明Treg能分泌IL-10，而IL-10能夠進一步誘導(dǎo)Treg分化，使機體免疫功能低下或受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細胞能夠逃避免疫監(jiān)督，從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。這也為以后肝癌免疫治療的研究提供了新的途徑。

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