鄧建良,談華陽(yáng),王維民,周 炎,許春妮,張國(guó)強(qiáng)

(江蘇大學(xué)附屬宜興市人民醫(yī)院醫(yī)院腫瘤科,江蘇宜興,214200)

胃癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在中國(guó),胃癌的發(fā)生率和病死率均居惡性腫瘤前列。目前,臨床上手術(shù)切除是治療早期胃癌的最有效手段,但研究[1]發(fā)現(xiàn),術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%,且患者生存獲益也低于預(yù)期,5年生存率僅為20%～50%,進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后不佳,平均生存期6～8個(gè)月,通過(guò)化療平均可以延長(zhǎng)3～6個(gè)月。目前,鉑類藥是治療胃癌的常用藥物。順鉑作為第3代鉑類化合物,已被證實(shí)在對(duì)抗多種惡性腫瘤化療中具有良好的療效,含順鉑的方案治療胃癌總體有效率為38%～54%[2]。重組人血管內(nèi)皮抑素注射液(恩度)是中國(guó)學(xué)者自主研發(fā)的一類生物新藥,也是全球首個(gè)成功用于臨床的血管內(nèi)皮抑素類藥物。其能與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行特異性的結(jié)合,阻斷其分子信號(hào)通路,通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)期凋亡來(lái)抑制新生血管生成,從而抑制腫瘤組織生長(zhǎng)。本研究擬通過(guò)恩度聯(lián)合順鉑作用于人胃癌細(xì)胞株SGC7901和BGC823,以初步探討其對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑:順鉑(德州德藥制藥有限公司產(chǎn)品,批號(hào):120306);重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(山東先聲麥得津生物制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字:S20050088);鼠抗人Bcl-2、Ki-67單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基1640、胰蛋白酶和胎牛血清(美國(guó)Gibco lifetechologies公司);二甲基亞砜 DMSO和四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國(guó)Sigma公司);Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)biovision公司);丙烯酰胺和N,N,-甲叉雙丙烯酰胺(上海生工生物工程公司);人胃癌細(xì)胞株SGC7901和BGC823(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)。儀器:550型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);DY 602V穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(江蘇南達(dá)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);TS-1型脫色搖床(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠);CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司);FACS Vantage SE型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將人胃癌細(xì)胞株BGC823和人胃癌細(xì)胞株SGC7901培養(yǎng)在RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng),每3 d或細(xì)胞鋪滿瓶底后,用0.25%胰蛋白酶消化。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定:MTT法測(cè)定單藥組(僅適用順鉑)和聯(lián)合組(恩度聯(lián)合順鉑)對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC823和人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖的影響,具體步驟如下:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,用培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液,調(diào)整懸液濃度為5×104個(gè)細(xì)胞/mL,并將其加至96孔板中。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組(設(shè)3孔平行),陽(yáng)性對(duì)照組(設(shè)3孔平行)和實(shí)驗(yàn)組,其中實(shí)驗(yàn)組又分為單藥組和聯(lián)合組,且每種藥物濃度梯度均設(shè)3孔平行,將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h。單藥組分別將 1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的順鉑加入到96孔板內(nèi);聯(lián)合組在單藥組基礎(chǔ)上再加入100 mg/L的恩度注射液。37℃恒溫培養(yǎng)24 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT后,再置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)4 h,2 000 r/min離心5 min,棄去上清,每孔再加入 200 μ L的 DMSO,輕輕混勻 10 min,在570 nm下檢測(cè)光密度值(OD)值。通過(guò)OD值分別計(jì)算單藥組和聯(lián)合組對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞和人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率。公式如下:細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組 OD值均數(shù)/對(duì)照組OD值均數(shù))×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:實(shí)驗(yàn)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、單藥組(單用順鉑)和聯(lián)合組(恩度聯(lián)合順鉑),單藥組選取上述實(shí)驗(yàn)中單用順鉑增殖抑制率(fa)為0.5時(shí)的藥物濃度作為處理濃度,聯(lián)合組則選取上述實(shí)驗(yàn)恩度和順鉑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)增殖抑制率為0.5時(shí)的藥物濃度作為處理濃度。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,用培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液,調(diào)整懸液濃度為2×105個(gè)細(xì)胞/mL,并將其接種于50 mL培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h,2 000 r/min離心5 min,棄去上清,分別單用順鉑和采用恩度聯(lián)合順鉑進(jìn)行處理,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,0.25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞,檢測(cè)在上述藥物濃度下的細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 蛋白Bcl-2和Ki-67表達(dá)的檢測(cè):Western blot檢測(cè)Bcl-2、Ki-67的蛋白表達(dá)。采用 BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定所收集樣品中的蛋白濃度。進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,用5%的β-巰基乙醇處理樣品,沸水浴5 min,使待測(cè)樣品充分變性后,每份樣品點(diǎn)樣 50 μ g蛋白,100 V恒壓電泳100 min。將檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,將轉(zhuǎn)膜槽置于冰浴中,60 V下電泳2 h。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶在室溫下將膜封閉100 min,用TBS緩沖液洗膜3次,10 min/次。再將膜與一抗置于4℃下孵育過(guò)夜。取出并洗膜,用5%脫脂牛奶稀釋二抗,將膜與相應(yīng)的二抗置于室溫下,孵育100 min后,取出并洗膜。取等量的ECL發(fā)光劑A、B,將其混勻后滴在膜上,棄去殘余發(fā)光劑,將膜置于X光片夾中下,先將X片進(jìn)行顯影后再進(jìn)行定影,將膠片進(jìn)行掃描。

2 結(jié) 果

2.1 單藥組和聯(lián)合組對(duì)BGC823和SGC7901細(xì)胞的抑制作用

單藥組和聯(lián)合組對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞株和人胃癌SGC7901細(xì)胞株的抑制作用在一定范圍內(nèi)均隨藥物濃度的增加而增強(qiáng);在3個(gè)濃度梯度上,聯(lián)合組的抑制作用均強(qiáng)于單藥組。見(jiàn)表1。

2.2 單藥組和聯(lián)合組半數(shù)抑制濃度比較

單藥組對(duì)BGC823細(xì)胞的IC50為20.77mg/L,聯(lián)合組IC50為9.66 mg/L;單藥組對(duì)SGC7901細(xì)胞的IC50為30.30mg/L,聯(lián)合組IC50為11.55 mg/L。單藥組對(duì) BGC823細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的IC50均低于聯(lián)合組。

表1 2組對(duì)BGC823細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的制率比較(n=3, ±s)

表1 2組對(duì)BGC823細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的制率比較(n=3, ±s)

與單藥組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

組別 濃度/(mg/L)BGC823細(xì)胞抑制率/%SGC7901細(xì)胞抑制率/%單藥組 1 12.73±3.08 10.65±3.12 10 33.92±3.42 31.82±3.58 100 75.67±4.15 68.69±4.50聯(lián)合組 1+100 18.16±2.82 19.14±2.53＊10+100 45.37±4.24＊ 50.23±4.12＊＊100+100 85.39±5.16 76.59±3.88

2.3 各組對(duì)BGC823和SGC7901細(xì)胞凋亡的影響

BGC823細(xì)胞對(duì)照組、單藥組及聯(lián)合組的凋亡率分別為(2.02±0.35)%、(15.57±2.12)%、(19.88±3.32)%;SGC7901細(xì)胞對(duì)照組、單藥組及聯(lián)合組的凋亡率分別為(1.88±0.29)%、(13.33±3.05)%、(18.26±3.58)%。聯(lián)合組對(duì)誘導(dǎo)BGC823和SGC7901細(xì)胞的凋亡率有高于單藥組的趨勢(shì),且顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞的凋亡情況

圖2 誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞的凋亡情況

2.4 蛋白印跡法結(jié)果

蛋白印跡結(jié)果顯示,單藥組與聯(lián)合組分別對(duì)BGC823細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的Bcl-2和 Ki-67蛋白表達(dá)有所下調(diào),且聯(lián)合組下調(diào)程度顯著大于單藥組(P<0.05),見(jiàn)圖3、4。

3 討 論

順鉑瘤譜較廣,對(duì)胃癌、腸癌、頭頸部癌、食管癌等均有效,且患者對(duì)不良反應(yīng)的耐受性明顯提高[3-6]。盡管采用含順鉑的化療方案治療后療效有了一定提高,但腫瘤患者的生存獲益仍沒(méi)有明顯改善,對(duì)于晚期胃癌患者的治療尤其如此,所以亟須探索新的治療理念及治療方法。目前,在臨床工作中,抗血管生成治療已逐漸成為研究的熱點(diǎn),國(guó)內(nèi)外已采用多種作用于不同位點(diǎn)的血管生成抑制劑類新藥用于晚期腫瘤的治療。

隨著分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的不斷發(fā)展,關(guān)于胃癌的發(fā)病機(jī)制、分子信號(hào)通路和治療靶點(diǎn)的研究也有了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。目前,臨床上已取得一些突破,如運(yùn)用西妥昔單抗[7]、貝伐單抗[8]和曲妥珠單抗[9]等具有明確靶點(diǎn)的單克隆抗體類生物藥聯(lián)合傳統(tǒng)化療治療進(jìn)展期胃癌。恩度是一種多靶點(diǎn)的血管生成抑制劑,研究[10]表明,其能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體,通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡來(lái)發(fā)揮抑制新生血管生成的作用。此外,恩度還能通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來(lái)抑制新生血管的生成,并可間接誘導(dǎo)腫瘤休眠或退縮[11]。臨床上,恩度聯(lián)合化療已用于多種晚期實(shí)體腫瘤的治療,且其與化療聯(lián)合治療胃癌已取得了良好的療效[12-14]。

圖3 BGC823細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)

圖4 SGC7901細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)

恩度聯(lián)合化療藥物用于胃癌治療的基礎(chǔ)研究較少?；谠鰪?qiáng)化療療效與減輕化療相關(guān)的不良反應(yīng),作者設(shè)計(jì)了此項(xiàng)恩度聯(lián)合順鉑干預(yù)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的體外實(shí)驗(yàn),并以檢測(cè)Bcl-2及Ki-67蛋白作為細(xì)胞增殖與凋亡的指標(biāo)。通過(guò)檢測(cè)Ki-67、Bcl-2蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),順鉑聯(lián)合恩度作用于SGC7901及BGC823細(xì)胞時(shí),其下調(diào) Bcl-2、Ki-67表達(dá)的作用顯著優(yōu)于單用順鉑。本研究結(jié)果提示,恩度可增敏順鉑,抑制胃癌細(xì)胞 BGC823及SGC7901細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,作用機(jī)制是增強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和抑制細(xì)胞增殖,這為恩度治療胃癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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