王洪州，鄧麗娟，王利民，董發(fā)勤

(1.四川綿陽四0四醫(yī)院，川北醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 綿陽 621000;2.西南科技大學(xué)校長辦公室，四川 綿陽 621000)

國際上對溫石棉的生物安全性存在較大爭議［1，2］，一些學(xué)者認(rèn)為溫石棉的毒性和溫石棉的所帶金屬離子、表面電荷、產(chǎn)地等性質(zhì)有較大關(guān)系;另一些學(xué)者認(rèn)為溫石棉的代用纖維也能夠引起慢性肺炎，并且發(fā)現(xiàn)巖棉纖維可引起基因突變。也有學(xué)者認(rèn)為溫石棉與煙溶液聯(lián)合對人胚肺細(xì)胞DNA的損傷具有協(xié)同作用［3～6］。由此可見溫石棉的代用纖維對人體可能也不安全。2008年7月至2013年7月本研究利用免疫組化方法檢測腫瘤基因表達，一方面擬證實其毒性，另一方面探討其致癌的部分機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細(xì)胞來源:中國倉鼠肺細(xì)胞(Chinese Hamster Lung Cell，V79細(xì)胞)購買自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心生物醫(yī)學(xué)實驗室。②溫石棉:四川新康溫石棉，陜西陜南溫石棉、玻璃纖維，陶瓷纖維，硅灰石，巖棉來自四川西南科技大學(xué)實驗室。③兔抗鼠EGFR、Survivin單克隆抗體購于武漢博士德公司。④免疫組化SABC試劑盒(SA1022)購于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 制備實驗組粉體及其懸液 先將各實驗原礦處理成長度5 μm左右，具體方法:將實驗原礦反復(fù)碾壓、劈分、剪短后，然后再進行細(xì)研磨，之后進行篩選過濾;然后烘干，最后研磨成更細(xì)的粉體。其電鏡圖片如圖1。用高溫殺菌消毒各種實驗粉體，配置成6 個不同濃度(1、2、4、6、8、10 mg/L)。

圖1 溫石棉及其代用品粉體的掃描電鏡圖 a:四川新康溫石棉;b:陜西陜南溫石棉;c:玻璃纖維;d:陶瓷纖維;e:巖棉;f:硅灰石

1.2.2 免疫組組織化學(xué)檢測腫瘤基因鈣激活蛋它43(calciumactinated protein 43，CAP43)及 B 淋巴細(xì)胞癌-2(B-cell lymghoma，Bcl-2)的表達

1.2.2.1 實驗分組 實驗共分為7組，四川新康溫石棉組(A組)、陜西陜南溫石棉組(B組)、玻璃纖維組(C組)、陶瓷纖維組(D組)、硅灰石組(E組)、巖棉組(F組)和陰性對照組(G組)。

1.2.2.2 干預(yù)措施 將各實驗組6種粉體的6個不同濃度(1、2、4、6、8、10 mg/L)的粉體懸液分別取1 ml滴到各個細(xì)胞培養(yǎng)孔中。將染毒的細(xì)胞放到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進行免疫組化檢測。G組為陰性對照組，不加入上述任何粉體懸液，其他步驟同上。

1.2.2.3 檢測方法 預(yù)先將處理后的蓋玻片放入6孔板里，將細(xì)胞接種到蓋玻片上，細(xì)胞量為2×105/孔。將調(diào)整好的細(xì)胞懸液1 ml，分別加入到培養(yǎng)板各孔中。然后把接種到培養(yǎng)板的細(xì)胞放入到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將小鼠分為6組，每組3只，將六種粉體懸液的6個不同濃度的粉體懸液分別取1 ml滴到各個細(xì)胞培養(yǎng)孔中。將染毒的細(xì)胞放到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進行免疫組化檢測。第7組為空白對照組，不加入上述任何粉體懸液，其他步驟同上。CAP43以及Bcl-2的免疫組織化學(xué)染色根據(jù)SABC法進行，主要步驟:①將染毒的細(xì)胞放到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，吸盡6孔板培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，滴入丙酮處理30 min，吸盡每孔中的丙酮，蒸餾水沖洗3次;②30%的H2O21份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水沖洗3次;③滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗;④每孔滴入一抗，Survivin以及EGFR稀釋度為1∶200。37℃下孵育60 min，然后置4℃冰箱過夜;⑤室溫下復(fù)溫20 min，PBS(pH 7.2～7.6)沖洗5 min×3次;⑥滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗2 min×3次;⑦滴加試劑SABC，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×4次;⑧新鮮配制的DAB溶液顯色5 min;⑨自來水沖洗后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水封片。

1.2.2.4 免疫組化染色結(jié)果判斷及分析 陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或胞核呈棕黃色。倒置顯微鏡下隨機選取3個視野(10×40)，用Image-ProPlus專業(yè)圖像分析系統(tǒng)檢測其平均光密度(OD)值，再進行統(tǒng)計學(xué)分析處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析及SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各實驗組及對照組的免疫組化染色結(jié)果見圖2～圖5，OD值測定結(jié)果見表1～表2。CAP43、Bcl-2在陰性對照組未見表達(見圖4、圖5)，在 A、B、C、D、E、F各組內(nèi)不同濃度間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Survivin的陽性表達主要在細(xì)胞漿，細(xì)胞膜和細(xì)胞核有少量表達;EGFR的表達主要分布于V79細(xì)胞的細(xì)胞漿，在細(xì)胞核亦有少量表達。不同濃度溫石棉及其代用品粉體懸液染毒V79細(xì)胞后，A、B組與其它組比較，EGFR、Survivin的表達最強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);A組和B組比較，EGFR、Survivin的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);各組隨粉體濃度增加，EGFR、Survivin的表達均逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，呈現(xiàn)濃度依賴性。

圖2 粉體作用72 h后CAP43基因在B組V79中的表達(10×20)

圖3 粉體作用72 h后BCL-2基因在A組V79中的表達(10×20)

圖4 陰性對照組免疫組化染色CAP43基因呈陰性表達(10×20)

圖5 陰性對照組免疫組化染色BCL-2基因基因呈陰性表達(10×40)

表1 CAP43基因在V79細(xì)胞中的表達 (OD值)

表2 Bcl-2基因在V79細(xì)胞中的表達 (OD值)

3 討論

Bcl-2是近年較受關(guān)注的一個凋亡抑制基因，Bcl-2的表達提示細(xì)胞凋亡受到抑制［7］，該基因定位于人染色體18q21上，蛋白主要表達于腫瘤細(xì)胞漿及細(xì)胞膜。研究認(rèn)為，Bcl-2在多種惡性腫瘤(膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、腎癌等)中存在特異性表達，且其表達與腫瘤大小、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［8］。從本實驗結(jié)果中可以看出不同濃度溫石棉及其代用品處理倉鼠肺細(xì)胞72小時后，出現(xiàn)Bcl-2基因表達的顯著上調(diào)，并以陜西陜南溫石棉組及四川新康溫石棉組為最明顯，提示溫石棉及其代用品致癌的可能機制與Bcl-2基因高表達，從而促進細(xì)胞惡變相關(guān)。

CAP43基因定位于人類染色體8q24，又名N-myc下游調(diào)節(jié)基因(NDRG1)，在正常組織中表達很低，但廣泛表達于人類多種腫瘤組織如在肺癌、腦腫瘤、黑色素瘤、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌中，CAP43蛋白過量表達［9，10］。從本實驗結(jié)果中可以看出不同濃度溫石棉及代用品粉體處理倉鼠肺細(xì)胞72小時后，出現(xiàn)CAP43基因表達的顯著上調(diào)，并以陜西陜南溫石棉組及四川新康溫石棉組為最明顯，提示溫石棉及其代用品粉體致癌的可能機制與CAP43在細(xì)胞組織中表達顯著升高相關(guān)。

從本實驗結(jié)果中可以看出不同濃度溫石棉及代用品粉體處理V79細(xì)胞72小時后可使細(xì)胞受損，從而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞CAP43和Bcl-2基因表達的上調(diào)，隨著暴露濃度的增加，CAP43和Bcl-2的表達呈進一步上調(diào)趨勢。由此可見溫石棉及其代用品具有潛在致癌性，其部分機制可能為上調(diào)腫瘤基因CAP43和Bcl-2的表達，進而誘發(fā)細(xì)胞癌變。但是，從實驗本身來說，還存在如下問題，溫石棉以及其代用品是如何影響CAP43和Bcl-2的表達，通過什么物質(zhì)進行影響，影響通道是什么還需要進一步考察。筆者認(rèn)為，在后期的試驗中，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)增加A組以及B組的樣本量，仔細(xì)考察溫石棉以及其代用品對于CAP43和Bcl-2的作用途徑。但總的來說，本文為后期實驗起到了鋪墊作用，通過本文實驗數(shù)據(jù)分析，溫石棉及其代用纖維對于鼠細(xì)胞CAP43和Bcl-2表達有顯著的增強作用。

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