李俊良 史彬林 閆素梅 金 鹿 徐元慶 李倜宇 郭祎瑋 郭曉宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

仔豬在斷奶時(shí)自身的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，而斷奶將中斷其母源抗體供應(yīng)，這將損傷或抑制其免疫功能，導(dǎo)致仔豬在斷奶后易出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、腹瀉、感染疾病及死亡率升高等仔豬斷奶綜合征［1-3］。在傳統(tǒng)的仔豬的生產(chǎn)過程中，經(jīng)常通過在飼糧中添加抗生素來促進(jìn)仔豬的健康生長(zhǎng)，然而在抗生素帶了巨大的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也引發(fā)了藥物殘留、藥物抵制等一系列嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)［4-5］。因此，開發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)作用、天然綠色的抗生素替代品對(duì)促進(jìn)斷奶仔豬的健康生長(zhǎng)和保障畜產(chǎn)品的安全有重要的意義。甲殼素是真菌細(xì)胞壁及蝦、蟹等節(jié)肢類動(dòng)物外殼的主要成分之一。殼聚糖是由甲殼素脫乙酰基得到的一種天然的、無毒的、可生物降解的、帶正電荷的堿性多糖［6］。研究表明，殼聚糖能夠影響動(dòng)物機(jī)體內(nèi)花生四烯酸(araehidonieaeid，AA)的代謝進(jìn)而可能影響機(jī)體的免疫功能。AA的代謝網(wǎng)絡(luò)是炎癥代謝網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)核心網(wǎng)絡(luò)［7］。在正常的生理狀態(tài)，機(jī)體中AA濃度很低，當(dāng)細(xì)胞膜受到各種刺激時(shí)(如炎癥、寄生蟲等)，細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)催化作用下可以生成 AA［8-9］。AA 在體內(nèi)主要有2條代謝途徑:一是在環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)作用下最終產(chǎn)生多種前列腺素，二是在脂氧化酶(lipoxygenase，LOX)作用下最終產(chǎn)生白細(xì)胞三烯等激素類物質(zhì)，而產(chǎn)物中的前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能:PGE2可增強(qiáng)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的趨化反應(yīng)等;LTB4可誘導(dǎo)活化抑制性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(N-K細(xì)胞)等［8-10］。Bianeo等［11］研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖可以激活巨噬細(xì)胞的胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)，進(jìn)而促進(jìn)了AA的釋放。Usami等［12］的試驗(yàn)表明殼聚糖能刺激犬多形核細(xì)胞合成并釋放PGE2和LTB4。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對(duì)肉仔雞免疫功能的影響可能與其提高肉仔雞血清AA濃度、cPLA2活性及小腸胞內(nèi)cPLA2 mRNA表達(dá)有關(guān)［13］。盡管人們對(duì)殼聚糖影響動(dòng)物機(jī)體內(nèi)AA的代謝有了初步的研究，但是有關(guān)殼聚糖對(duì)斷奶仔豬機(jī)體內(nèi)AA代謝的研究較少，且有關(guān)殼聚糖通過影響AA代謝來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的分子機(jī)理也不太清楚。為此，本試驗(yàn)旨在以斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)為研究對(duì)象，深入研究不同水平殼聚糖對(duì)斷奶仔豬PBLs中AA代謝網(wǎng)絡(luò)途徑中主要參與炎癥反應(yīng)或免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì)、關(guān)鍵控制酶及其基因表達(dá)的影響，以期為揭示殼聚糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能途徑和促進(jìn)其在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用殼聚糖(食品級(jí)，CAS RN.:9012-76-4)購(gòu)買于濟(jì)南海德貝海洋生物有限公司，黏度為45 mPa·s，脫乙酰度為85.09%。

1.2 淋巴細(xì)胞的采集與分離

試驗(yàn)所用淋巴細(xì)胞采于1頭健康的28日齡斷奶的三元雜交仔豬(杜×大×長(zhǎng))。在無菌采血后用豬淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD，中國(guó))按照說明書分離淋巴細(xì)胞。血樣在800×g離心分離20 min，收集的淋巴細(xì)胞用 RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))洗滌2次。將淋巴細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色法在光學(xué)顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)后，再懸于適量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基［100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清和25 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液］中。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

調(diào)整淋巴細(xì)胞密度為1×106個(gè)細(xì)胞/mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，接種于2個(gè)24孔板中，每孔接種量為1 mL，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。殼聚糖的添加濃度為0、40、80、160和320μg/mL，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)24 h后，每孔中加入200μL最終濃度為16μmol/mL刀豆蛋白A(Sigma公司，美國(guó))來刺激細(xì)胞的分化。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，離心后收集上清液(800×g，在4℃下離心 10 min)，凍存于 -20℃，待測(cè)定cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及 AA、PGE2和LTB4的濃度;收集細(xì)胞，凍存于-80℃，待分析cPLA2、COX-2和5-LOX mRNA的表達(dá)。

1.4 上清液中指標(biāo)檢測(cè)

上清液中cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及AA、PGE2和LTB4的濃度采用放射免疫法測(cè)定，所用儀器為中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司生產(chǎn)的GC-911-γ-放射免疫計(jì)數(shù)器。試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.5 細(xì)胞中RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

淋巴細(xì)胞中總RNA用RNAiso試劑盒(大連寶生物，中國(guó))按照說明書進(jìn)行提取，RNA的完整性用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析檢測(cè);RNA的純度在多功能酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)上用/來確定;RNA的濃度在多功能酶標(biāo)儀上讀取。取適量的RNA用PrimeScript RT試劑盒(大連寶生物，中國(guó))進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為10μL，其中含有0.5μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I、2 μL 5 × PrimeScript Buffer、0.5 μL Random 6mers、0.5 μL Oligo dT Primer和適量的無酶水;反應(yīng)條件為:37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.6 相對(duì)熒光定量

引物用NCBI網(wǎng)站上的在線引物設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index)，由上海生工生物工程有限公司合成。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為管家基因，對(duì)各個(gè)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。各基因的引物序列見表1。

采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(大連寶生物，中國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μL，其中10μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM、0.4μL上游引物(10μmol/L)、0.4μL下游引物 (10μmol/L)、2μL的cDNA模板和7.2μL無酶水。用Bio-Rad實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))進(jìn)行 β-actin、cPLA2、COX-2 和5-LOX基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后在70～95℃繪制熔解曲線。反應(yīng)過程中用無酶水作為陰性對(duì)照，基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法［14］計(jì)算。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)單一熔解曲線峰進(jìn)行確定后，再取5μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確定產(chǎn)物片段大小后，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序來確定產(chǎn)物序列。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequences

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后，采用SAS 9.0軟件中回歸分析程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)含不同水平殼聚糖的處理進(jìn)行線性和二次回歸分析。P＜0.05代表回歸關(guān)系顯著;P＜0.01代表回歸關(guān)系極顯著。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖對(duì)斷奶仔豬PBLs培養(yǎng)液中cPLA2、COX-2和 5-LOX活性及 AA、PGE2和 LTB4濃度的影響

由表2可知，隨著殼聚糖添加水平的升高，PBLs培養(yǎng)液中的cPLA2、COX-2和5-LOX活性及AA、PGE2和LTB4濃度呈顯著的二次曲線變化(P＜0.05)，且上述所有指標(biāo)的最大值出現(xiàn)在殼聚糖的添加水平為80～160μg/mL時(shí)。然而，當(dāng)殼聚糖的添加水平增加到320μg/mL時(shí)，以上各指標(biāo)的值有不同水平的降低。這表明殼聚糖的添加水平與 cPLA2、COX-2、5-LOX 活性及 AA、PGE2、LTB4濃度之間存在二次劑量依賴關(guān)系。

2.2 殼聚糖對(duì)斷奶仔豬PBLs培養(yǎng)液中cPLA2、COX-2和5-LOX基因表達(dá)的影響

由表3可知，隨著殼聚糖添加水平的升高，PBLs中cPLA2、COX-2和5-LOX mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈顯著的二次曲線變化(P＜0.05)，且上述所有指標(biāo)的最大值出現(xiàn)在殼聚糖的添加水平為80～160μg/mL時(shí)。然而，當(dāng)殼聚糖的添加水平增加到320μg/mL時(shí)，以上各指標(biāo)的值有不同水平的降低。這說明在殼聚糖的添加水平與cPLA2、COX-2和5-LOX mRNA的相對(duì)表達(dá)量之間也存在二次劑量依賴關(guān)系。

3 討論

AA是機(jī)體內(nèi)一種分布最廣的、屬于n-6系列的多不飽和的必需脂肪酸。體內(nèi)大部分AA是以sn-2位置酯化的形式存在于細(xì)胞膜磷脂當(dāng)中，沒有生物活性;少量AA以游離的形式存在于細(xì)胞質(zhì)和體液中，具有活性［15］。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)(如炎癥、寄生蟲等)，在細(xì)胞膜cPLA2的作用下釋放AA［8-9］。cPLA2是細(xì)胞內(nèi) PLA2主要亞型，并能夠特異性水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵進(jìn)而產(chǎn)生大量的AA［16］。在本試驗(yàn)中，殼聚糖不僅增加了斷奶仔豬PBLs培養(yǎng)液中的AA濃度，而且提高了AA的代謝關(guān)鍵酶cPLA2的活性和淋巴細(xì)胞中cPLA2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。此外，殼聚糖對(duì)上述指標(biāo)的影響都呈現(xiàn)出一定的二次劑量依賴關(guān)系。這表明適當(dāng)水平的殼聚糖可能通過提高控制AA生產(chǎn)的關(guān)鍵酶cPLA2的活性及其基因表達(dá)進(jìn)而影響AA的代謝。Bianeo等［11］研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)水平(0.01% ～0.05%)的殼聚糖，可以顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放AA，而高水平(＞0.05%)的殼聚糖沒有使AA發(fā)生顯著變化，并認(rèn)為殼聚糖激活了cPLA2從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放AA。程富勝等［17］報(bào)道蕨麻多糖能夠影響小鼠淋巴細(xì)胞AA代謝水平從而影響了機(jī)體免疫機(jī)能。李慧英等［13］研究指出，殼聚糖可以顯著提高肉仔雞血清中AA濃度、cPLA2活性及小腸胞內(nèi)cPLA2 mRNA的表達(dá)。本試驗(yàn)的結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。試驗(yàn)中PBLs中AA濃度的升高可能是由于殼聚糖激活了PBLs中cPLA2 mRNA的表達(dá)引起cPLA2活性升高所致。

表2 殼聚糖對(duì)斷奶仔豬PBLs培養(yǎng)液中cPLA2、COX-2和5-LOX活性及AA、PGE2和LTB4濃度的影響Table 2 Effects of chitosan on cPLA2，COX-2 and 5-LOX activities and AA，PGE2 and LTB4 concentrations in PBLs medium of weaner piglets

表3 殼聚糖對(duì)斷奶仔豬PBLs培養(yǎng)液中cPLA2、COX-2和5-LOX基因表達(dá)的影響Table 3 Effects of chitosan on the expressions of cPLA2，COX-2 and 5-LOX genes in PBLs medium of weaner piglets

AA在體內(nèi)主要有2條代謝途徑:一是在COX作用下先生成不穩(wěn)定的環(huán)內(nèi)過氧化物前列腺素G2(PGG2)和前列腺素H2(PGH2)，PGH2在PGE酶的催化下生成PGE2和血栓素A2;二是在5-LOX作用下，生成5-羥基過氧化二十碳四烯酸，接下來被氧化成白三烯A4和5-羥基二十碳四烯酸，白三烯A4可以進(jìn)一步生成LTB4等激素類物質(zhì)，AA及其代謝產(chǎn)物具有參與細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)等重要的生理功能［8-10，15］。在本試驗(yàn)中，隨著殼聚糖添加水平的升高，PBLs培養(yǎng)液中的COX-2和5-LOX的活性及PGE2和LTB4濃度呈現(xiàn)顯著的二次曲線升高;與之對(duì)應(yīng)的 PBLs中COX-2和5-LOX的mRNA相對(duì)表達(dá)量也呈現(xiàn)顯著的二次曲線升高。這表明殼聚糖不僅影響AA的產(chǎn)生，而且還可以影響AA的COX和LOX代謝途徑的代謝產(chǎn)物、關(guān)鍵酶及其基因表達(dá)。Usami等［12］報(bào)道殼聚糖能夠刺激犬多形核細(xì)胞合成并釋放PGE2和LTB4。李慧英［17］研究指出殼聚糖可以顯著提高肉仔雞血清中PGE2和LTB4的濃度。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，適量的殼聚糖可以影響AA的COX和LOX代謝途徑，這與前人的研究結(jié)果相近。AA的代謝網(wǎng)絡(luò)是炎癥反應(yīng)的主要網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)中的COX-2是環(huán)氧合酶途徑中催化AA產(chǎn)生PGE2的一種重要的誘導(dǎo)酶，5-LOX是脂氧化酶途徑中催化 AA 產(chǎn)生 LTB4 的關(guān)鍵酶［7，10，16］。盡管有關(guān)殼聚糖對(duì)淋巴細(xì)胞中COX-2和5-LOX的mRNA表達(dá)影響的報(bào)道較少，但本試驗(yàn)的結(jié)果表明淋巴細(xì)胞上清中PGE2和LTB4濃度及COX-2和5-LOX的活性可能是由于殼聚糖提高淋巴細(xì)胞中COX-2和5-LOX的mRNA表達(dá)所致。AA的代謝產(chǎn)物中的PGE2和LTB4具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能:PGE2可增強(qiáng)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的趨化反應(yīng)等;LTB4可誘導(dǎo)活化抑制性T細(xì)胞和N-K細(xì)胞等［8-10］，這表明殼聚糖可能通過對(duì)AA的下游代謝途徑的影響進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。此外，也有研究表明殼聚糖可以抑制脂多糖(LPS)所誘導(dǎo)的RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞中PGE2濃度和COX-2基因表達(dá)的升高［18］。這表明殼聚糖對(duì)PGE2的產(chǎn)生具有雙向調(diào)節(jié)作用，即單獨(dú)添加殼聚糖可以促進(jìn)機(jī)體PGE2的產(chǎn)生，而當(dāng)在受到外界刺激時(shí)(如LPS)殼聚糖又能抑制PGE2的大量產(chǎn)生。

傳統(tǒng)上，人們認(rèn)為AA及其代謝產(chǎn)物是致炎因子，然而有研究表明AA還是一個(gè)非常重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生物活動(dòng)［15］。由此可見，AA的代謝對(duì)機(jī)體的影響是復(fù)雜多樣的，需要我們做更深入的研究來探尋其未知的、具體的功能。在本試驗(yàn)中，適當(dāng)水平的殼聚糖促進(jìn)了斷奶仔豬PBLs內(nèi)AA代謝網(wǎng)絡(luò)途徑中參與炎癥或免疫調(diào)節(jié)的主要介質(zhì)PGE2和LTB4的產(chǎn)生，提高了關(guān)鍵控制酶cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及其基因表達(dá)。本試驗(yàn)的結(jié)果也為進(jìn)一步揭示殼聚糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能途徑和促進(jìn)其在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)的結(jié)果表明:適當(dāng)水平的殼聚糖可以促進(jìn)斷奶仔豬PBLs內(nèi)AA代謝網(wǎng)絡(luò)途徑中參與炎癥或免疫調(diào)節(jié)的主要介質(zhì)PGE2和LTB4的產(chǎn)生，提高關(guān)鍵控制酶cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及其基因表達(dá)，這可能是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的原因之一。

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