杜偉利，王嘉欣，惠 李，趙鑫麗，趙曉霞，王珍琦，劉 揚，張 萱

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院基因組醫(yī)學(xué)研究中心，吉林 長春 130021；2.北京市通州區(qū)衛(wèi)生局衛(wèi)生監(jiān)督所，北京 101100；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院腎病內(nèi)科，吉林 長春 130041）

組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2（transglutaminase 2，TGM2）又稱谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，是小腸上皮細胞產(chǎn)生的酶，可催化蛋白質(zhì)或多肽中特異的谷氨酰胺殘基的脫酰胺作用和轉(zhuǎn)酰胺基作用，在腸上皮下細胞高表達。TGM2對谷蛋白有強親和力，是谷蛋白抗體產(chǎn)生的關(guān)鍵分子，可催化谷氨酰胺自身或與其他細胞外蛋白交聯(lián)形成聚合物，該聚合物可被抗原提呈細胞識別和吸收[1]。TGM2的脫酰胺作用可增強谷蛋白T細胞抗原表位對MHC classⅡ分子（HLA-DQ2或 HLA-DQ8）的親和力，提呈疾病相關(guān)抗原表位給CD4＋T細胞，刺激抗體產(chǎn)生。

TGM2和一些人類疾病緊密相關(guān)，如乳糜瀉、神經(jīng)退行性病變、癌癥、炎癥和組織纖維化等。乳糜瀉，也被稱為谷蛋白敏感性腸道疾病，是一種小腸多因素疾病[2]。TGM2基因已被確定為乳糜瀉的易感基因之一。近年研究[3]發(fā)現(xiàn)：兒童時期具有乳糜瀉病史的人群成年后其精神分裂癥的患病風險高達3倍，精神分裂癥患者血漿谷蛋白抗體水平顯著增高，無谷蛋白膳食可改善精神分裂癥患者的精神癥狀。這些發(fā)現(xiàn)提示：谷蛋白可能是精神分裂癥發(fā)病的一種環(huán)境觸發(fā)因子。2009年，Bradford等[4]在對131個英國精神分裂癥核心家系進行TGM2基因與精神分裂癥發(fā)病的連鎖不平衡研究中發(fā)現(xiàn)：rs2076380、rs7270785、rs4811528和s6023526 4個單核苷核多態(tài)性（SNPs）位點與精神分裂癥發(fā)病密切相關(guān)，TGM2基因可能賦予精神分裂癥發(fā)病易感性。本研究采用大樣本病例－對照關(guān)聯(lián)研究方法，進一步在中國北方漢族人群中探討TGM2基因與精神分裂癥發(fā)病及臨床表型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本組所有樣本均為中國北方漢族人。精神分裂癥患者428例，來自吉林省長春市心理醫(yī)院2005—2008年住院患者，經(jīng)2位經(jīng)驗豐富的臨床醫(yī)師按照國際疾病分類標準第10版（ICD-10）精神分裂癥診斷標準確診為精神分裂癥，平均年齡（39.15±12.56）歲。健康對照組555例，來源于醫(yī)院工作人員及健康獻血者，平均年齡（38.61±13.27）歲，身體健康，無嚴重的軀體疾病，無精神疾病及精神疾病家族史。

1.2 樣本的收集及基因組DNA的提取 精神分裂癥患者與健康對照個體經(jīng)知情同意后，采集外周靜脈血5mL，－20℃分裝保存。采用Promage DNA純化試劑盒提取基因組DNA，具體方法參見文獻[5]。

1.3 引物設(shè)計與合成 利用國際互聯(lián)網(wǎng)（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNPs）在人類基因組數(shù)據(jù)庫中檢索TGM2基因的基因組序列，利用Primer 5軟件在各SNPs位點上、下游設(shè)計引物。各SNPs位點見表1，引物序列見表2。PCR擴增體系及條件參照文獻 [5]。

表1 TGM2基因各SNPs位點Tab.1 SNPs at each site of TGM2gene

表2 TGM2基因各SNPs位點的PCR引物序列及限制性內(nèi)切酶Tab.2 PCR primers and restriction endonucleases used for SNPs genotypes at TGM2locus

1.4 限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物 反應(yīng)體系及條件參照文獻 [5]。反應(yīng)體系20μL，包括PCR擴增產(chǎn)物15μL，10× Buffer 2μL，BSA 0.2μL，限制性內(nèi)切酶0.8μL（表1），用滅菌水補足體積。37℃消化過夜后，用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，根據(jù)酶切圖譜判斷個體基因型。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，應(yīng)用χ2檢驗進行等位基因、基因型關(guān)聯(lián)分析及臨床表型分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析 rs2076380位點PCR擴增片段長度為280bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BstNⅠ消化后，形成95和185bp 2個片段，3種基因型：A/A純合切開型、A/G雜合型和G/G純合未切開型（圖1）；rs7270785位點PCR擴增片段長度為485bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶FokⅠ消化后，形成209和276bp 2個片段，3種基因型：G/G純合切開型、G/T雜合型和T/T純合未切開型（圖2）；rs4811528位點PCR擴增片段長度為246bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶MspⅠ消化后，形成99和147bp 2個片段，3種基因型：G/G純合切開型、G/A雜合型和A/A純合未切開型（圖3）；rs6023526位點：PCR擴增片段長度為374bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶MspⅠ消化后，形成165和209bp 2個片段，3種基因型：C/C純合切開型、C/T雜合型和 T/T純合未切開型（圖4）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗 擬合優(yōu)度χ2檢驗結(jié)果顯示：4個SNPs位點的基因型頻數(shù)分布在病例組和對照組中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P＞0.05），說明本研究所應(yīng)用的樣本來自于隨機婚配群體。見表3和4。

圖1 rs2076380位點限制性酶切電泳圖Fig.1 Electrophoregram of rs2076380after BstN Ⅰdigestion

圖2 rs7270785位點限制性酶切電泳圖Fig.2 Electrophoregram of rs7270785after FokⅠdigestion

圖3 rs4811528位點限制性酶切電泳圖Fig.3 Electrophoregram of rs4811528after MspⅠdigestion

2.3 等位基因和基因型關(guān)聯(lián)性分析 rs2076380、rs7270785、rs4811528和rs6023526 4個SNPs位點的等位基因在病例組和對照組中的頻數(shù)分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.831，P＝0.362；χ2＝0.591，P＝0.442；χ2＝0.296，P＝0.586；χ2＝0.092，P＝0.762）；3種基因型在病例組和對照組的頻數(shù)分布比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝1.951，P＝0.377；χ2＝1.399，P＝0.497；χ2＝0.313，P＝0.855；χ2＝0.701，P＝0.704）。提示rs2076380、rs7270785、rs4811528和rs6023526位點與精神分裂癥發(fā)病無關(guān)聯(lián)。見表5和6。

圖4 rs6023526位點限制性酶切電泳圖Fig.4 Electrophoregram of rs6023526after MspⅠdigestion

表3 病例組TGM2基因各SNPs位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗Tab.3 Goodness-of-fitχ2 test for Hardy-Weinberg equilibrium of SNPs sites of TGM2gene in case group

表4 健康對照組TGM2基因各SNPs位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗Tab.4 Goodness-of-fitχ2 test for Hardy-Weinberg equilibrium of SNPs sites of TGM2gene in control group

表5 病例組及對照組TGM2基因各SNPs位點等位基因頻數(shù)分布Tab.5 Distribution of allelic frequencies of SNPs sites of TGM2gene in case group and control group [n（η/%）]

2.4 TGM2基因與精神分裂癥行為學(xué)臨床表型的關(guān) 系 rs2076380、rs7270785、rs4811528 和rs6023526 4個SNPs位點基因型與真性聽幻覺、關(guān)系妄想、影響妄想、自罪妄想、虛無妄想、被洞悉感、被迫害妄想、嫉妒妄想、夸大妄想、鐘情妄想、其他妄想、思維連貫性障礙、思維邏輯性障礙、古怪行為、攻擊性行為、幻覺－妄想綜合征等陽性表型及與思維貧乏、情感遲鈍/淡漠、意志缺乏等陰性表型均無關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。進一步證明TGM2基因與中國漢族人群精神分裂癥發(fā)病無關(guān)聯(lián)。見表7和8。

表6 病例組及對照組TGM2基因各SNPs位點基因型頻數(shù)分布Tab.6 Distribution of genotypic frequencies of SNPs sites of TGM2gene in case group and control group [n（η/%）]

表8 TGM2基因各SNPs位點基因型與精神分裂癥陰性臨床表型的相關(guān)性Tab.8 Association between genotypes of SNPs sites of TGM2gene and negative symptoms of schizophrenia

3 討 論

在過去的20年中，精神分裂癥的遺傳學(xué)研究獲得了較大進展，數(shù)百種基因被鑒定與精神分裂癥發(fā)病密切相關(guān)[6]。但是，精神分裂癥易感基因本身并不能單獨致病，需要和環(huán)境因素共同作用而誘發(fā)疾病。至于哪些環(huán)境因素參與發(fā)病，環(huán)境因素通過何種途徑和機制與遺傳因素相互作用而導(dǎo)致疾病的發(fā)生目前尚未闡明，這將是未來精神遺傳學(xué)研究的最重要問題之一。精神分裂癥具有自身免疫性疾病的特點，其發(fā)病與炎癥性細胞因子失衡密切相關(guān)。精神分裂癥患者存在免疫功能異常，抗精神病藥物具有免疫抑制效應(yīng)。鑒于此，有學(xué)者認為精神分裂癥可能是一種自身免疫問題，免疫反應(yīng)可能在精神分裂癥發(fā)病的遺傳與環(huán)境因素間發(fā)揮橋梁作用。

飲食中的谷蛋白是一種重要的環(huán)境風險因子。早在上世紀七十年代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)小麥面筋的主要成分谷蛋白與精神分裂癥有密切關(guān)系。對谷蛋白過敏者易患乳糜瀉，成年乳糜瀉患者常常伴有精神分裂癥臨床表現(xiàn)。在不明原因的精神分裂癥患者中，未確診的乳糜瀉發(fā)病率高達16%?？刂凭穹至寻Y患者攝入富含谷蛋白的食品可明顯改善精神癥狀。這些結(jié)果提示：針對谷蛋白的免疫反應(yīng)是精神分裂癥發(fā)病的重要因素。

本課題組近期研究[7]發(fā)現(xiàn)：精神分裂癥患者血漿 Anti-Gliadin IgA陽性率、Anti-Gliadin IgA水平與健康對照相比均顯著增高，提示谷膠蛋白IgA抗體與中國漢族人群精神分裂癥發(fā)病密切相關(guān)。在IgA陽性個體中，進一步檢測其血清中脫酰胺基谷膠蛋 白 衍 生 肽 抗 體（anti-gliadin-related GAF-3X peptides）和TGM2抗體水平，發(fā)現(xiàn)Anti-Gliadin（GAF-3X）IgA 和 Anti-TGM2IgA 與健康對照相比均顯著降低，提示TGM2可能參與了中國漢族人群精神分裂癥的發(fā)病。

本研究中，本文作者選擇了Bradford等在英國精神分裂癥核心家系的連鎖不平衡研究中發(fā)現(xiàn)的rs2076380、rs7270785、rs4811528 和 s6023526 4個SNPs位點，利用病例－對照關(guān)聯(lián)研究方法，在中國北方漢族人群中探討TGM2基因與精神分裂癥發(fā)病的關(guān)系，結(jié)果顯示：TGM2基因的rs2076380、rs7270785、rs4811528和rs6023526位點與精神分裂癥發(fā)病及臨床表型無關(guān)聯(lián)。本研究未能驗證Bradford等的陽性研究結(jié)果。其中的因素可能為：①TGM2基因是中國漢族人群精神分裂癥 相 關(guān) 基 因， 但 rs2076380、rs7270785、rs4811528和rs6023526位點并非疾病致病位點，而是與致病位點緊密連鎖，不排除TGM2基因其他SNPs位點與精神分裂癥相關(guān)聯(lián)；②精神分裂癥是一種復(fù)雜的多基因遺傳病，多個致病的微效基因可能由于各自的作用相對較小而單獨分析時難以被檢測；③由于不同地域、種族和群體之間存在遺傳結(jié)構(gòu)差異，精神分裂癥發(fā)病存在遺傳異質(zhì)性，TGM2基因不是中國漢族人群精神分裂癥候選基因。

雖然本研究未能證實TGM2基因與精神分裂癥相關(guān)聯(lián)，但是并不能就此否定TGM2基因與精神分裂癥發(fā)病的關(guān)系。近期研究[8]發(fā)現(xiàn)：TGM2的rs6023059位點與女性雌激素結(jié)合受體變異導(dǎo)致的雙向情感障礙相關(guān)。研究[9]發(fā)現(xiàn)：TGM2的rs4811528位點與精神分裂癥患者血漿IL-2水平相關(guān)，提示TGM2可能與精神分裂癥患者免疫功能紊亂有關(guān)。TGM2廣泛分布于全身，腦內(nèi)最明顯。有研究[10－11]表明：TGM2與亨延頓舞蹈癥有關(guān)，亨延頓舞蹈癥蛋白聚合物的交聯(lián)反應(yīng)可能部分源于TGM2的活性，亨延頓舞蹈癥與精神分裂癥在遺傳上相關(guān)，而亨延頓舞蹈癥蛋白聚體的形成并不是導(dǎo)致精神分裂癥的重點，腦內(nèi)TGM2的活性和作用才是關(guān)鍵。如果免疫系統(tǒng)識別了TGM2，那么TGM2分子就會成為腦內(nèi)各疾病易感區(qū)域相關(guān)損傷的觸發(fā)因子。因此，TGM2位點可能不是導(dǎo)致精神分裂癥的特異性基因，但可能是一種特殊的致病基因。

[1]Teshigawara K， Kannagi R， Noro N，et al. Possible involvement of transglutaminase in endocytosis and antigen presentation [J].Microbiol Immunol，1985，29（8）：737-750.

[2]Green PHR，Jabri B.Coeliac disease [J].Lancet，2003，362（9381）：383-391.

[3]De Santis A，Addolorato G，Romito A，et al.Schizophrenic symptoms and SPECT abnormalities in a coeliac patient：regression after a gluten-free diet [J].J Intern Med，1997，242（5）：421-423.

[4]Bradford M，Law MH，Stewart AD，et al.The TGM2gene is associated with schizophrenia in a British population [J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2009，150B（3）：335-340.

[5]王姣艷，張 麗，吳 江，等.TNXB基因多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)性分析 [J].吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，36（2）：359-363.

[6]俞 瓊，付穎利，馮 佳，等.5-羥色胺1A受體基因多態(tài)性與精神分裂癥關(guān)聯(lián)性的Meta分析 [J].吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，37（4）：678-681.

[7]Jin SZ，Wu N，Xu Q，et al.A study of circulating gliadin antibodies in schizophrenia among a Chinese population [J].Schizophr Bull，2012，38（3）：514-518.

[8]Graae L，Karlsson R，Paddock S.Significant association of estrogen receptor binding site variation with bipolar disorder in females[J].PLoS One，2012，7（2）：e32304.

[9]Bradford M，Law MH，Megson IL，et al.The functional significance of the TGM2gene in schizophrenia：a correlation of SNPs and circulating IL-2levels [J].J Neuroimmunol，2011，232（1/2）：5-7.

[10]Karpuj MV，Becher MW，Steinman L.Evidence for a role for transglutaminase in Huntington＇s disease and the potential therapeutic implications [J]. Neurochem Int， 2002，40（1）：31-36.

[11]Uan Dujin E，Kingma E，van der Mast R.Psychopathology in verified Huntington’s disease gene carriers [J].J Neuropsychiatry Clin Neurosci，2007，19（4）：441-448.