張曉春，鄭曉敏，陳 誠，李義德

（1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院兒科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，寧夏 銀川 750004）

同種造血干細胞移植（allogeneic stem cell transplantation，allo-SCT）后，移植物抗白血病效應(yīng)（graft versus ceukemia，GVL）由細胞毒性T細胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞所介導[1]，是白血病患者得以治愈的關(guān)鍵反應(yīng)。近年來研究[2]表明：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）在NK細胞和CTL細胞介導的抗腫瘤免疫中發(fā)揮極其重要的作用。t（17；19）-急性淋巴細 胞 白 血 病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）預后極差，來源于t（17；19）（q21-q22；p13）的致癌基因E2A-HLF阻斷內(nèi)源性凋亡通路，在白血病形成及化療藥物耐受中起關(guān)鍵作用[3]。（17；19）-ALL患者多于診斷后2年內(nèi)復發(fā)，但allo-SCT可 改 善 其 預 后[4]。 國 內(nèi) 外 已 有 相 關(guān) 研究[5－7]表 明：重 組 人 可 溶 性 TRAIL（rhsTRAIL）對乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤和肺癌等具有抗腫瘤效應(yīng)，但rhsTRAIL對t（17；19）-ALL作用的研究尚少。本研究擬通過t（17；19）-ALL細胞株對rhsTRAIL的敏感性初步分析其可能作用機制，探討其臨床意義，為臨床治療t（17；19）-ALL提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 t（17；19）-ALL細胞株4株（Endo-kun、HAL-O1、UOC-B1和 YCU-B2），混合譜系白血?。∕LL）ALL（MLL＋-ALL）細胞株9株（KOPN1、KOPB26、KOCL33、KOCL 44、KOCL 45、KOCL 50、KOCL 51、KOCL 58和 KOCL 69），Ph1＋-ALL細 胞 株 6 株（KOPN30bi、KOPN 57bi、KOPN 66bi、KOPN 72bi、YAMN73 和 YAMN 91），前B ALL細胞株13株，包括t（1；19）細胞 株 7 株（697、 KOPN34、 KOPN 36、KOPN 60、KOPN 63、YAMN90和YAMN 92）、t（ 12；21）細胞株1株（Reh）及其他細胞株5株（KOPN35、KOPN 61、KOPN 62、KOPN 79和KOPN 84），以上細胞株均來自日本山梨大學醫(yī)學部小兒科。細胞株用含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱。取處于對數(shù)生長期細胞進行實驗。1例t（17；19）-ALL患者的骨髓經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離出單核細胞（原始細胞＞95%），RPMI 1640培養(yǎng)液離心洗滌，懸于含10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液中。患者標本的使用經(jīng)寧夏醫(yī)科大學倫理委員會批準。Annexin-V-FITC、藻紅蛋白（PE）標記的抗生物素蛋白鏈菌素、Caspase廣 譜 抑 制 劑z-VAD-fmk和 rhsTRAIL（Killer TRAIL）分別購自BestBio、Invitrogen、Sigma和Alexis公司。死亡受體4（DR4）、死亡受體5（DR5）、誘騙受體1（DcR1）及誘騙受體 2（DcR2）單克隆抗體購自美國Accurate公司，鼠抗人PARP、caspase-3為美國BD公司產(chǎn)品，鼠抗人caspase-8單抗、tubulin和兔抗人Bid抗體為日本MBL公司產(chǎn)品。

1.2 TRAIL受體在細胞表面的表達 取細胞懸液，加入1μg生物素標記的鼠IgG1或者DR4、

DR5、DcR1及DcR2的單克隆抗體，冰上孵育30min；加入PE標記的抗生物素蛋白鏈菌素，冰上孵育30min后上流式細胞儀檢測。相對熒光強度（RFI）＝特異染色的平均熒光強度/對照染色的平均熒光強度。以RFI代表受體表達水平。

1.33H標記的胸腺嘧啶（3H-thymidine）法檢測rhsTRAIL對細胞增殖的抑制作用 調(diào)整細胞濃度為1.0×109L－1，接種于經(jīng)紫外線消毒的96孔平底培養(yǎng)板中，每孔 100μL（終濃度 0.5×108L－1），每組設(shè)3個平行樣。添加3倍稀釋的rhsTRAIL（最終濃度分別為11、33和100μg·L－1），按指定方法孵育36h，在培養(yǎng)的最后6h內(nèi)給予脈沖（每孔1μCi），隨即收集至玻璃纖維濾器；不添加孔作為對照組。用液體閃爍計數(shù)器計算整合入DNA的放射活性。rhsTRAIL的阻斷率＝（1－處理孔每分鐘記數(shù)次數(shù)/未處理孔每分鐘記數(shù)次數(shù)）×100%。t（17；19）-ALL細胞株添加rhsTRAIL（100μg·L－1），加入TRAIL中和抗體 RIK-2（10g·L－1）或caspase抑制劑z-VAD-fmk（20mmol·L－1）培養(yǎng)42h，在最后6h按上述方法檢測3H-thymidine吸收；不添加者作為對照組。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 取細胞懸液，接種于經(jīng)紫外線消毒的24孔板，每孔1mL（終濃度 1×108L－1）。TRAIL 孔 加 入 rhsTRAIL 100μg·L－1，對照孔加入新鮮培養(yǎng)液，12h后收集細胞。FITC標記的Annexin-V染色，采用流式細胞儀（BD，F(xiàn)ACSCalibur）檢測細胞早期凋亡率。

1.5 免疫印跡法檢測caspase-8、Bia、caspase-3和PARP表達 取細胞懸液，接種于經(jīng)紫外線消毒的24孔板，每孔1mL（終濃度1×105L－1）。TRAIL孔加入rhsTRAIL 100μg·L－1，對照孔加入新鮮培養(yǎng)液，24h后收集細胞，用NP液制備細胞裂解液并進行蛋白定量。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%TBS脫脂奶封閉，加入鼠抗人caspase-8、Bid、caspase-3和PARP，4℃孵育過夜。PBS洗滌3次后加入二抗振蕩反應(yīng)1h。TBST洗3次，TBS洗1次。ECL放射自顯影，掃描圖像保存。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。細胞增殖抑制率、細胞凋亡率和TRAIL受體表達水平以中位數(shù)及95%可信區(qū)間（95%CI）表示，組間比較采用秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組ALL細胞株TRAIL受體表達 采用流式細胞術(shù)檢測TRAIL受體DR4、DR5、DcR1和DcR2在細胞表面的表達。t（17；19）-ALL細胞株表面DR4和DR5均為陽性表達，而DcR1和DcR2呈陰性表達。t（17；19）-ALL細胞株DR4表達水平（RFI）為1.91，明顯高于 MLL＋-ALL、Ph1＋-ALL和其他前 B-ALL 細胞株（均P＜0.05）；DR5表達水平明顯高于 MLL＋-ALL細胞株（P＜0.05）。見表1。

表1 TRAIL受體在ALL細胞株表面的表達水平Tab.1 Expression levels of TRAIL receptors on surface of ALL cell lines [M（95%CI）]

2.2 各組ALL細胞株的增殖抑制率 不同濃度的rhsTRAIL均能夠抑制t（17；19）-ALL細胞株的增殖（圖1A），且隨著rhsTRAIL濃度增加抑制作用增強，rhsTRAIL濃度為100μg·L－1時，4株細胞增殖完全被抑制。這種抑制作用在添加TRAIL中和抗體RIK2或caspase抑制劑z-VAD-fmk后被阻斷（圖1B），提示rhsTRAIL對t（17；19）-ALL細胞株增殖的抑制作用為TRAIL特異性，并依賴于caspase。添加rhsTRAIL培養(yǎng)后，t（17；19）-ALL、MLL＋-ALL、Ph1＋-ALL和其他前B-ALL細胞株的細胞增殖抑制 率 分 別 是 100.00%、4.95%、49.56% 和24.63%，4株t（17；19）-ALL細胞株增殖抑制率顯著高于9株 MLL＋-ALL細胞株（P＜0.01）、6株P(guān)h1＋-ALL細胞株（P＜0.05）和13株其他前B-ALL細胞株（P＜0.05）。

2.3 各組 ALL細胞株凋亡率及caspase-8、Bid、caspase-3和PARP的表達 rhsTRAIL處理4株t（17；19）-ALL細胞株后，細胞早期凋亡明顯（圖2），其凋亡率分別由未處理時的9%、19%、10%和8%上升為85%、97%、98%和91%，而相同條件下，對rhsTRAIL耐受的MLL＋-ALL細胞株KOPN30bi凋亡率僅由6%上升至7%。rhsTRAIL處理后，t（17；19）-ALL細胞早期凋亡率與KOPN30bi細胞株比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫印跡法檢測結(jié)果顯示：在rhsTRAIL作用2h內(nèi)，caspase-8、Bid、caspase-3和PARP的活化條帶出現(xiàn)，并隨時間推移逐漸強化。見圖3。

2.4 t（17；19）-ALL原代細胞檢測結(jié)果 患者白血病細胞的DR4和DR5表達水平（RFI）與t（17；19）-ALL細胞株相似；添加rhsTRAIL培養(yǎng)后，細胞增殖受到抑制，并發(fā)生早期凋亡。?

圖1 不同濃度rhsTRAIL作用下t（17；19）-ALL細胞株的增殖抑制率（A）及特異性（B）Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of t（17；19）-ALL cell lines（A）after treated with different rhsTRAIL and its sensitivity（B）

圖2 rhsTRAIL對t（17；19）-ALL細胞株早期凋亡的誘導作用Fig.2 Induction of rhsTRAIL in apoptosis in t（17；19）-ALL cell lines

3 討 論

腫瘤的免疫監(jiān)視受到固有免疫和適應(yīng)性細胞免疫的調(diào)控，其中主要包括CTL和NK細胞，其表達的TRAIL在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著極其重要的作用[8－9]。目 前 發(fā) 現(xiàn) 的 TRAIL 受 體 中，DR4（TRAIL-R1）和DR5（TRAIL-R2）與 TRAIL結(jié)合后，將死亡信息傳遞至細胞內(nèi)，激活細胞內(nèi)信號系統(tǒng)，最終導致細胞凋亡[10]。DcRl（TRAIL-R3）和 DcR2（TRAIL-R4）競 爭 DR4 和 DR5 與TRAIL的結(jié)合[11]。

圖3 rhsTRAIL對t（17；19）-ALL細胞株凋亡通路的激活作用Fig.3 Activation of rhsTRAIL in apoptosis pathway in t（17；19）-ALL cell lines

正常細胞中，誘騙受體（DcR）表達占優(yōu)勢，腫瘤細胞由于缺乏DcR的保護而易被TRAIL殺傷，因此TRAIL有別于其他TNF家族成員TNF和FasL的高毒性，能選擇性誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞幾乎無毒性[12－13]，這一特性使其在腫瘤治療上有廣泛的應(yīng)用前景，成為近年來腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點。國內(nèi)外前期臨床試驗[5－7]結(jié)果顯示：重組TRAIL蛋白對乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤和肺癌等具有抗腫瘤效應(yīng)，其抗腫瘤譜廣，療效明顯。

t（17；19）（q21-q22；p13）是一種較罕見的易位，形成融合基因E2A-HLF，見于不足1%的ALL患兒[3]。伴有該基因的ALL以B前體細胞表型、高血鈣癥和獲得性凝血異常為特點[4]。近年來隨著化療方案的進步，兒童及青少年ALL長期預后得到顯著改善，但t（17；19）-ALL治療效果仍極差，有報道該類患兒5年死亡率高達66%～100%。國外14例化療的個案報道中，13例t（17；19）-ALL患兒在診斷2年內(nèi)復發(fā) [第1次完全緩解（CR）中位數(shù)為9個月]，僅1例第1次CR期（診斷后13周）進行了同種骨髓移植的患兒維持CR至42個月[4]，表明早期進行allo-SCT有助于延長患兒無病生存時間。因此，為探討allo-SCT對改善t（17；19）-ALL預后的臨床意義，有必要明確t（17；19）-ALL細胞是否對TRAIL敏感，從而最終對GVL效果敏感。

本研究結(jié)果顯示：rhsTRAIL處理t（17；19）-ALL細胞后，細胞早期凋亡率明顯高于對照細胞株，細胞增殖受到顯著抑制，與對照細胞株比較差異有統(tǒng)計學意義，這種抑制作用在添加TRAIL中和抗體RIK2或caspase廣譜抑制劑z-VAD后被阻斷，提示t（17；19）-ALL細胞株對rhsTRAIL的敏感性為TRAIL特異性并依賴于caspase的活性。本研究發(fā)現(xiàn)：t（17；19）-ALL細胞株表面DR4和DR5表達均為陽性，且其表達水平明顯高于其他前B-ALL細胞株，提示t（17；19）-ALL細胞株對rhsTRAIL高度敏感，其細胞表面DR4和DR5的高表達發(fā)揮了重要作用。

TRAIL與其死亡受體（DR）結(jié)合后，形成死亡誘導信號復合物，促使procaspase-8在局部募集并自我裂解形成有活性的凋亡起始蛋白caspase-8，后者切斷procaspase-3，激活外源性凋亡通路[14]，同時催化Bcl-2家族蛋白Bid斷裂，激活內(nèi)源性凋亡通路[15]。由于雙重促凋亡途徑的激活，TRAIL可有效誘導腫瘤細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：rhsTRAIL處理t（17；19）-ALL細胞株后2h內(nèi)，caspase-8、caspase-3、Bid和PARP均發(fā)生不同程度活化，且活化作用隨時間推移而增強，提示內(nèi)源性、外源性凋亡通路均受到激活是t（17；19）-ALL細胞株對rhsTRAIL高度敏感的另一個重要原因。

綜上所述，因細胞表面高表達DR4、DR5以及內(nèi)源性和外源性凋亡通路的激活，t（17；19）-ALL細胞對TRAL誘導的細胞毒作用敏感。t（17；19）-ALL對化療反應(yīng)不佳，臨床應(yīng)盡早進行allo-SCT，從而改善其預后。融合基因E2A-HLF對t（17；19）-ALL細胞 TRAIL死亡受體的作用及其機制將是下一步的研究重點。

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