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1.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650021；2. 云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

天然蝦青素對(duì)大鼠MCAO模型的保護(hù)作用研究

潘雷1周瑩1劉路明1萬(wàn)慶家2孫承鋒1尹勇1遲越2*

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650021；2. 云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

目的: 探討天然蝦青素對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法: 采用線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷(MCAO)模型，以神經(jīng)學(xué)評(píng)分、腦梗塞體積、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察天然蝦青素的腦保護(hù)作用。結(jié)果: 天然蝦青素能夠明顯改善模型動(dòng)物的神經(jīng)病學(xué)癥狀，縮小腦梗塞體積，升高血清SOD活性，降低血清MDA水平。結(jié)論: 天然蝦青素在防治大鼠腦缺血/再灌注損傷方面具有明顯作用，其作用與抗氧化損傷有關(guān)。

蝦青素；腦缺血/再灌注；抗氧化

天然蝦青素(astaxanthin)是廣泛存在于人類(lèi)日常食物中的一種具有極強(qiáng)抗氧化活性的類(lèi)胡蘿卜素，雖然其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于β-胡蘿卜素(β-carotene)和葉黃素(lutein),但純品蝦青素的抗氧化活性卻是兩者的5～15倍[1]。大量研究表明，天然來(lái)源的抗氧化劑如維生素E[2]、銀杏提取物[3]、番茄紅素[4]等對(duì)哺乳類(lèi)動(dòng)物中風(fēng)模型具有顯著的腦保護(hù)作用，臨床研究顯示[5]，男性吸煙者經(jīng)常食用富含抗氧化活性的食物可降低腦梗塞的風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)合這些報(bào)道提示，具有抗氧化活性的成分或許能夠減輕缺血所導(dǎo)致的腦神經(jīng)損傷。為探討天然來(lái)源的蝦青素是否也具有對(duì)抗腦缺血/再灌注損傷的作用，故進(jìn)行本文的研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑 蝦青素，云南白鷗制藥有限公司提供，批號(hào)：20140321，純度90%；依達(dá)拉奉購(gòu)自Adamas Reagent Co.,Ltd.； 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；SOD試劑盒和MDA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；水合氯醛:分析純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重250～300g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2008-24。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(infinite M200 PRO)；臺(tái)式低速離心機(jī)(上海電機(jī)廠)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(依達(dá)拉奉：10mg/kg，ip.)、蝦青素高劑量藥組(10mg/kg，花生油配制，ig.)和蝦青素低劑量藥組(5mg/kg，花生油配制，ig.)，每組8只。假手術(shù)組分離大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)外動(dòng)脈，但不插魚(yú)線，灌胃給予花生油；模型組，復(fù)制MCAO模型，灌胃給予給予花生油；陽(yáng)性對(duì)照組、蝦青素高、低劑量藥組，預(yù)防性連續(xù)給藥7d，末次給藥1h復(fù)制MCAO模型，每組動(dòng)物手術(shù)缺血2h，再灌注24h，進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.2 大鼠MCAO模型復(fù)制 參照Longa[6]等報(bào)道的方法，稍加改進(jìn)，采用線栓法復(fù)制短暫性大鼠腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 神經(jīng)學(xué)評(píng)分 復(fù)制MCAO模型后，采用改良的Bederson法[7](見(jiàn)表1)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。

表1 改良Bederson法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3.2 TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)染色及腦梗死體積的測(cè)定 缺血2h再灌注24h時(shí)，各組大鼠用10% 水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，常規(guī)方法分離血清備用，斷頭取腦，沿腦橋上界面切斷，去除嗅球，稱全腦重，立即放入-20℃冰箱，20min 后取出。由前向后做連續(xù)冠狀切片，共5片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)；第二刀在視交叉處；第三刀在漏斗柄處；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。將腦切片置入0.1% TTC溶液中，后放入恒溫振蕩器中，37℃避光染色30min。將腦切片取出后放入4% 中性多聚甲醛中固定24h，取出腦片，用數(shù)碼相機(jī)拍照，用Motic Images Plus 2.0 顯微圖象分析系統(tǒng)計(jì)算梗塞面積(粉紅色為未受損的正常組織，而梗塞區(qū)則因線粒體損害不染色，呈白色)，由于水腫對(duì)其梗塞體積有影響，故采用公式對(duì)其修正。具體公式如下：

腦梗塞灶體積(mm3)=總梗塞面積×腦片厚度(2mm)

水腫修正后的腦梗塞灶體積(mm3)=梗塞體積×對(duì)側(cè)半球體積/同側(cè)半球體積

梗塞率(%)=水腫修正后的腦梗塞灶體積/雙側(cè)大腦半球體積×100%

1.2.3.3 血清SOD和MDA含量測(cè)定 嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 計(jì)量資料采用單因素方差分析法處理數(shù)據(jù)，方差齊者采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane′s法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 天然蝦青素對(duì)大鼠MCAO模型神經(jīng)病學(xué)癥狀的影響 結(jié)果顯示，天然蝦青素高、低劑量均能改善大鼠MCAO模型的神經(jīng)病學(xué)癥狀，詳見(jiàn)表2。

表2 天然蝦青素對(duì)大鼠MCAO模型神經(jīng)病學(xué)癥狀的影響(n=8)

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05。

2.1.2 天然蝦青素對(duì)大鼠MCAO模型腦梗塞體積的影響 結(jié)果顯示，天然蝦青素高、低劑量能顯著減少大鼠MCAO模型腦梗塞體積。詳見(jiàn)表3、圖1。

表3 天然蝦青素對(duì)大鼠MCAO模型腦梗塞體積的影響(n=8)

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05。

注：a：假手術(shù)組， b：模型組，c：依達(dá)拉奉，d：蝦青素高劑量，e：蝦青素低劑量

圖1各組對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的預(yù)防作用

2.1.3 天然蝦青素對(duì)大鼠MCAO模型血清SOD和MDA含量的影響 結(jié)果顯示，天然蝦青素可提高大鼠MCAO模型血清SOD含量，降低MDA含量，詳見(jiàn)表4。

表4 天然蝦青素對(duì)大鼠MCAO模型血清SOD和MDA含量的影響(n=8)

注：與假手術(shù)組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

2.2 討論

根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部公布的第三次全國(guó)慢性非傳染性疾病死因調(diào)查結(jié)果顯示，腦血管疾病已占死亡總數(shù)的22.45%，目前中國(guó)每年腦卒中新發(fā)病例有250萬(wàn)，而死于腦卒中的約有150萬(wàn)人，腦血管疾病已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病之一。在腦血管疾病中，缺血性腦血管病是其主要的組成部分，目前臨床治療缺血性人腦血管病主要采用溶栓藥物，但該治療方案時(shí)間窗較窄，若超過(guò)時(shí)間窗應(yīng)用溶栓藥物可帶來(lái)再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)，因此尋找更加安全有效的抗腦缺血損傷藥物是當(dāng)前腦血管疾病研究的重點(diǎn)之一。有證據(jù)表明，氧自由基增加是腦缺血/再灌注損傷的一個(gè)重要因素，自由基的鏈鎖反應(yīng)是腦組織缺血/再灌注損傷的核心病理環(huán)節(jié)，腦是含磷脂極豐富的器官，在自由基脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中可產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，間接反應(yīng)了體內(nèi)氧自由基的代謝情況，而超氧化物歧化酶(SOD)可催化1分子O2氧化生成O2，另一分子O2還原生成H2O2，后者通過(guò)過(guò)氧化酶作用還原成水，從而減少腦組織中氧自由基的含量，對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)組織的破壞，因此，具有抗氧化損傷活性的成分可能具有潛在的腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)的研究表明，天然蝦青素對(duì)大鼠MCAO模型的腦損傷具有顯著的保護(hù)作用，可以縮小腦梗塞體積，改善神經(jīng)病學(xué)評(píng)分，并且可明顯提高模型動(dòng)物血清中SOD活性,減少血清中MDA的含量，提示，天然蝦青素的抗氧化作用可能是其抗腦缺血/再灌注損傷的機(jī)制之一。

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Protectiveeffectofnaturalastaxanthinonratcerebralischemia/reperfusioninjury

PAN Lei1,ZHOU Ying1,LIU Lu-ming1,WAN Qing-jia2,SUN Cheng-feng1,YIN Yong1,CHI Yue2*

1.Department of Physical Medicine and Rehabilitation,the Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650021，China; 2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China

ObjectiveTo observe the effect of the natural astaxanthin on the rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury and detect the mechanism of it.MethodsThe middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was used. The neurological score, infarct volume, the content of SOD and MDA in the serum were evaluated.ResultsThe results showed that the natural astaxanthin could significantly improve the neurological symptoms, reduce the infarct volume, increase the activity of SOD and decrease the content of MDA in serum.ConclusionThe natural astaxanthin had a significant protective effect on rat cerebral ischemia/reperfusion injury. The mechanism may be related to antioxidant.

Astaxanthin;Cerebral ischemia/reperfusion injury;Antioxidant activity

云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010CD186)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2010C083)。

遲越,E-mail:1735871@qq.com

R965.1

A

1007-8517(2014)23-0009-03

2014.10.20)